IBDV絲素蛋白/殼聚糖DNA微球疫苗的制備及免疫原性分析

劉巖，呂志強(qiáng)，張存，祝新榮，石團(tuán)員，鐘石，孟智啟

1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所 浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州310021

2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021

傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease,IBD) 是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的三大主要傳染病之一，其病原傳染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus, IBDV) 主要侵害雛雞中樞免疫器官法氏囊，而引起免疫抑制為主的淋巴細(xì)胞衰竭綜合癥，進(jìn)而造成對多種病原的易感性增加和其他疫苗的免疫失敗。預(yù)防 IBD的傳統(tǒng)方法是用減毒疫苗或滅活苗免疫雞群，前者效果優(yōu)于后者。但減毒疫苗一般仍保留了對雛雞的中等毒力，基因工程亞單位疫苗則由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)與成本等問題，產(chǎn)業(yè)化難度較大。與此相比，DNA疫苗則具有不受母源抗體影響、無感染風(fēng)險(xiǎn)、可以同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[1]，但目前使用的DNA疫苗需要大劑量才能維持其免疫反應(yīng)，這與DNA疫苗肌注后，大部分在轉(zhuǎn)運(yùn)到組織細(xì)胞前發(fā)生降解失活，而致使轉(zhuǎn)運(yùn)到組織細(xì)胞 (特別是抗原遞呈細(xì)胞) 的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低[2-4]。

近年來在藥物遞呈上使用的微球技術(shù)為這一問題的解決提供了新思路[5-6]。目前微球給藥系統(tǒng)常用載體材料有PLGA、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物、蠶絲蛋白等生物降解材料。其中，來源于甲殼素脫乙?；a(chǎn)物的殼聚糖(Chitosan，CS) 因其價(jià)格低廉、來源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性和可降解性好、毒性極小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用作藥物、酶和疫苗的微球載體[7-9]。家蠶絲素蛋白 (Silk fibroin, SF) 是一種源于蠶絲的弱兩性氨基酸材料，與殼聚糖共混可交聯(lián)成半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可彌補(bǔ)殼聚糖球囊韌性差、降解快的缺點(diǎn)；同時(shí)也有利于改善單純絲素蛋白干燥后脆性變大、形態(tài)差異大、成型不理想等缺點(diǎn)[10]。為此，本研究利用絲素蛋白-殼聚糖兩種材料為壁材，以 IBDV DNA疫苗為芯材，研制緩釋 DNA微球疫苗，探索預(yù)防 IBD的新途徑，為研制新型雞傳染性法氏囊病毒疫苗進(jìn)行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蠶繭由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供；殼聚糖脫乙酰度90%，粘度＜100 cps (購自Sigma公司)；pCI-VP2/4/3質(zhì)粒[11]含 IBDV 多聚蛋白基因，由浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防獸醫(yī)研究所構(gòu)建并提供；質(zhì)粒提取相關(guān)試劑、PCR酶及電泳檢測試劑購自上海生工生物工程有限公司；其他生化試劑購自浙江長青化工公司。

1.2 質(zhì)粒DNA的大量制備與純化

堿裂解法大量抽提制備質(zhì)粒pCI-VP2/4/3，用Sepharose 2B過柱純化后溶于無菌PBS (pH 7.2)緩沖液中，紫外分光光度法測定核酸樣品的純度和濃度，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 殼聚糖及絲素蛋白溶液的制備

將殼聚糖以 1∶100的浴比溶解于 2%冰乙酸溶液中，形成無色透明粘稠溶液；調(diào)節(jié)pH為4.6、5.0、5.5并分別保存?zhèn)溆谩?/p>

配制0.5% Na2CO3水溶液，將剪碎的蠶繭按20 g/L比例投入并加熱煮沸0.5 h，取出用蒸餾水洗凈，重復(fù)兩次。50 ℃烘干后稱取適量脫膠蠶絲，按文獻(xiàn)[12]方法在60 ℃下溶解于9.3 mol/L LiBr，或在 80 ℃下溶解于氯化鈣三元溶解體系 (摩爾比為 CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8)[13-14]，先將無水C2H5OH和H2O 混合，然后把一定量的脫膠桑蠶絲 (剪成2 cm左右) 浸入其中，潤濕后加入無水CaCl2。攪拌，置60 ℃下繼續(xù)攪拌制得絲素溶膠。再經(jīng)半透膜 (MWCO 3500，Pierce) 在蒸餾水流水透析3 d除鹽，離心棄去溶解過程中的少量凝聚物，確定最后絲素溶液的濃度[15]。

1.4 微球的制備

1.4.1 戊二醛交聯(lián)劑法

[16]方法，取 50 mL液體石蠟和2 mL span-80在55 ℃左右攪拌片刻，緩慢加入1%的殼聚糖、DNA溶液，在55 ℃左右充分?jǐn)嚢璩蒞/O型乳液。調(diào)節(jié)乳液pH值在5.5，滴加pH 5.5的3%絲素蛋白溶液繼續(xù)攪拌，并將pH調(diào)至中性，緩慢加入適量戊二醛交聯(lián)，隨后室溫靜置數(shù)小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)離心分離、過濾、異丙醇和無水乙醇洗滌以及真空干燥得到粉末狀絲素蛋白殼聚糖DNA微球。

按上述方法，去除滴加絲素溶液和/或pCI-VP2/4/3 DNA溶液步驟，制備出殼聚糖微球、絲素蛋白殼聚糖微球、殼聚糖DNA微球。

1.4.2 Na2SO4沉淀法

參考文獻(xiàn)[17]和[18]在 Na2SO4溶液中配制不同濃度的質(zhì)粒DNA疫苗，將含DNA的Na2SO4溶液與殼聚糖溶液等比例混合，室溫?cái)嚢?0 min，自發(fā)形成乳白色微球，經(jīng) 10 000 r/min離心15 min，棄去懸浮液后，沉淀用無菌水保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 微球性狀的觀察

將不同條件下制備的微球分散在載玻片上，用倒置生物顯微鏡觀察微球形態(tài)，拍照記錄。另取適量微球液，通過激光納米粒度分析儀 (英國Malvern儀器有限公司) 測定其粒徑。參考文獻(xiàn)[19]將微球混合液 20 000×g離心20 min后，取上清溶液測定OD260，根據(jù)如下公式計(jì)算微球?qū)NA疫苗的荷載率：

參考文獻(xiàn)[18]通過在裸 DNA (3 μg溶解在20%的 Na2SO4)、微球懸浮液 10 μL (3 μg DNA)中加入DNaseⅠ，置37 ℃下作用15 min后電泳檢測各組的DNA完整性。

1.6 動(dòng)物試驗(yàn)的分組和免疫

14日齡非免疫雞隨機(jī)分成5組 (16只/組)，分別為pCI-VP2/4/3質(zhì)粒免疫組 (A組)、CS/pCIVP2/4/3微球免疫組 (B組)、SF-CS/pCI-VP2/4/3微球免疫組 (C組)、攻毒對照組 (D組) 和正常對照組 (E組)。肌肉多點(diǎn)注射，其中A組注射在 PBS 中溶解的重組質(zhì)粒 (1.0 μg/μL) 200 μL/只；B組、C組分別測定包封率后按200 μg/只的荷載DNA量進(jìn)行免疫；首免2 周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量與首免注射時(shí)相同。試驗(yàn)雞于首免前0 d、首免后7 d、14 d和加強(qiáng)免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 進(jìn)行心臟采血，室溫靜置分離血清，并于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗IBDV血清ELISA抗體效價(jià)的測定

所有試驗(yàn)組定期隨機(jī)采集 4 只雞外周血，室溫靜置分離血清，56 ℃滅活30 min，–20 ℃保存?zhèn)溆?。參照傳染性法氏囊病病毒ELISA抗體檢測試劑盒 (購自北京IDEXX生物科技有限公司) 操作說明進(jìn)行檢測，在650 nm測量記錄吸光值。根據(jù)試劑盒說明計(jì)算樣品 (Sample，S) 和陽性對照 (Positive control，P) 的S/P值，檢測各組樣品的 ELISA抗體水平。其中，樣品 S/P值≤0.2，判為陰性；樣品的S/P值>0.2判為陽性。

1.8 攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)組雞各取 8只，于加強(qiáng)免疫后 3周時(shí)分別攻擊中國標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85 株(100 bursal ID50/只，購自中國獸藥監(jiān)察所)，同時(shí)設(shè)置空白對照組隔離飼養(yǎng)，攻毒后連續(xù)觀察3 d。然后人工捕殺，稱取雞體重、法氏囊重和脾重，計(jì)算平均囊體比和脾體比，檢查雞的法氏囊、脾臟等器官的眼觀病變。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 11.0軟件包按生物統(tǒng)計(jì)學(xué)上的方差分析法對平均囊體比、平均脾體比、抗IBDV血清ELISA 抗體效價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 絲素蛋白溶液的制備

通過比較三元復(fù)合劑、氯化鋰、溴化鋰、稀鹽酸 4種溶劑溶解絲素后發(fā)現(xiàn)：氯化鋰溶液很難溶解絲素蛋白；稀鹽酸60 ℃下長時(shí)間處理后，絲素有一定的溶解，但殘余未溶解渣滓較多；三元CaCl2復(fù)合溶液、9.3 mol/L的溴化鋰兩種溶液能完全溶解絲素蛋白，溶解后的溶液粘稠微黃；但相比較而言，三元復(fù)合劑的溶解速度更快，成本更低。

2.2 Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備微球的比較

殼聚糖、DNA疫苗混合絲素蛋白溶液，在Na2SO4鹽溶液作用下，溶液發(fā)生凝聚形成白色濁狀物，離心后出現(xiàn)微球沉積在管底 (圖 1)。殼聚糖和絲素混合液在石蠟和 Span-80乳化下形成白色沉淀，逐滴加入適量戊二醛交聯(lián)后產(chǎn)生出淡黃色微球沉淀。

將Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備的微球上清、沉淀分別作為模板，進(jìn)行IBDV DNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，戊二醛交聯(lián)方法制備的殼聚糖DNA微球、絲素蛋白-殼聚糖DNA復(fù)合微球上清和沉淀均未擴(kuò)增到目的條帶；而以Na2SO4沉淀法制備微球沉淀中擴(kuò)增獲得相應(yīng)條帶，上清中無對應(yīng)條帶；表明戊二醛交聯(lián)影響了疫苗DNA正常的擴(kuò)增反應(yīng)活性，而Na2SO4沉淀法制備的微球中，荷載DNA能正常擴(kuò)增 (圖2)。

圖1 Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備的微球Fig. 1 Microspheres prepared in glutaraldehyde and Na2SO4 solution. 1: the SF/CS microspheres formed in Na2SO4 solution; 2: the emulsification products treated with paraffin and Span-80; 3: the microspheres products cross-linked by glutaraldehyde.

2.3 SF-CS微球工作條件的建立及其特性

對不同 Na2SO4濃度和殼聚糖 pH值條件下制備微球的檢測發(fā)現(xiàn)：不同Na2SO4濃度條件下均可形成球囊，微球形成速度與Na2SO4濃度呈正相關(guān)性，與pH呈負(fù)相關(guān)性 (圖3)；0.2%以上殼聚糖濃度在包囊效果上差異不明顯，但CS的pH顯著影響微球形成速度和微球粒徑大小；微球粒徑還與絲素蛋白濃度呈正相關(guān)關(guān)系，但不同絲素蛋白濃度對微球的電泳、DNA擴(kuò)增活性無明顯影響。綜合微球形態(tài)、荷載DNA活性等的檢測后，研究確定殼聚糖濃度0.5% (pH 5.0)，絲素蛋白濃度0.6%，質(zhì)粒DNA溶解在2% Na2SO4溶液中，配制成濃度500 μg/mL的工作條件。

圖 2 戊二醛交聯(lián)法和 Na2SO4沉淀制備上清及微球沉淀的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR product of the microsphere samples cross linked by glutaraldehyde and Na2SO4. 1: PCR product of pCI-VP2/4/3 plasmid as positive control; 2–5 samples were cross-linked by glutaraldehyde while lane 6–7 were prepared in Na2SO4 solution. 1:pCI-VP2/4/3 plasmid; 2: CS/pCI-VP2/4/3 supernatant;3: CS/pCI-VP2/4/3 precipitate; 4: SF-CS/pCI-VP2/4/3 supernatant; 5: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate; 6:SF-CS/pCI-VP2/4/3 supernatant; 7: SF-CS/pCIVP2/4/3 precipitate.

圖 3 不同 Na2SO4和殼聚糖 pH對微球形成的影響表現(xiàn)Fig. 3 Effects of Na2SO4 concentration and chitosan pH on the formation of microcapsules.

從圖 4結(jié)果可見，微球能有效保護(hù)荷載DNA疫苗免受DNaseⅠ的降解，粒徑儀檢測顯示SF-CS/pCI-VP2/4/3微球大小1.98 μm；荷載率89.14%。

圖4 DNase I對微球荷載DNA的消化表現(xiàn)Fig. 4 Digestion performance of different microsphere sample with or without DNaseⅠ. 1: DNA ladder’s three bands (2 000 bp, 1 000 bp and 750 bp from top to bottom) were showed respectively; 2–6 were samples treated before DNaseⅠdigestion while 7–11 were treated after DNaseⅠdigestion. 1: DNA ladder (DL2000); 2: pCI-VP2/4/3 plasmid in TE; 3:pCI-VP2/4/3 plasmid in 2% Na2SO4; 4: SF-CS/pCIVP2/4/3 supematant; 5: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate;6: SF-CS/pCI-VP2/4/3 microcapsule mixture; 7: SF-CS/pCIVP2/4/3 supematant; 8: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate;9: SF-CS/pCI-VP2/4/3 microcapsule mixture; 10:pCI-VP2/4/3 plasmid in TE; 11: pCI-VP2/4/3 plasmid in 2% Na2SO4.

2.4 抗IBDV血清ELISA抗體效價(jià)的測定

DNA 疫苗各試驗(yàn)組血清抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)規(guī)律如圖 5所示，免疫前后不同時(shí)間采集各組試驗(yàn)雞血清，檢測并計(jì)算出ELISA抗體水平 (S/P值表示)。首免后2周內(nèi)各疫苗組的抗IBDV血清ELISA 抗體效價(jià)均呈上升趨勢，且相互之間并無明顯差別。2周后的檢測發(fā)現(xiàn)微球DNA疫苗組的抗IBDV 血清ELISA抗體效價(jià)開始明顯高于單純pCI-VP2/4/3免疫組(P< 0.05)；特別是絲素蛋白-殼聚糖復(fù)合微球組，在之后的血清ELISA抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)檢測中呈現(xiàn)更高的上升趨勢，ELISA抗體效價(jià)優(yōu)于CS/pCI-VP2/4/3微球疫苗組(P< 0.05)。這說明微球佐劑能更好地保護(hù)DNA疫苗，有效誘導(dǎo)抗IBDV血清ELISA抗體。相比較單純的殼聚糖微球，添加絲素蛋白的復(fù)合微球?qū)Υ碳C(jī)體產(chǎn)生的抗 IBDV血清ELISA抗體水平更高，這也表明了絲素蛋白所具有的非特異性免疫促進(jìn)作用 (圖5)。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，正常對照組未檢測到抗 IBDV特異性抗體。

圖 5 DNA 疫苗各試驗(yàn)組外周血抗 IBDV血清ELISA抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)規(guī)律Fig. 5 Peripheral blood anti-IBDV ELISA antibody levels of chickens immunized with different DNA vaccines.

2.5 DNA疫苗各試驗(yàn)組對強(qiáng)毒的攻擊保護(hù)效果觀察

在加強(qiáng)免疫3周后，用中國標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊。攻毒3 d觀察發(fā)現(xiàn)攻毒對照組出現(xiàn)IBD典型的臨床癥狀、病理變化和組織學(xué)病變。病雞主要表現(xiàn)精神萎頓、羽毛蓬松、拉白色糞便，剖檢發(fā)現(xiàn)法氏囊和脾臟腫大。正常對照組和免疫組雞只精神良好，臨床表現(xiàn)上無明顯差異。剖取法氏囊、脾臟，計(jì)算囊體比 (B/B)、脾體比(S/B) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (表 1) 顯示：免疫組和正常對照組間囊體比、脾體比值無明顯差異；但均與攻毒對照組間有差異 (P<0.05)。

表1 不同疫苗組免疫后對強(qiáng)毒株BC6/85攻擊的保護(hù)效果比較Table 1 Comparison of protective immune responses of different IBDV DNA vaccine immunized chickens challenged by virulent strain BC6/85

3 討論

近年來，傳染性法氏囊病呈現(xiàn)發(fā)病季節(jié)不固定和發(fā)病日齡兩級分化的新特點(diǎn)，并隨著IBDV超強(qiáng)毒株、變異株，以及感染后疫苗接種副作用增加等問題的出現(xiàn)，使整個(gè)防治工作變得更加錯(cuò)綜復(fù)雜[20]。除了傳統(tǒng)的減毒和滅活疫苗外，國內(nèi)外研究者相繼針對 IBDV VP2或VP2/4/3基因開展了大量工作，研究出了不同來源、不同表達(dá)系統(tǒng)的 VP2或 VP2/4/3基因工程亞單位疫苗，盡管試驗(yàn)結(jié)果提示這種疫苗有良好的免疫原性，但應(yīng)用上仍不同程度地受到成本和實(shí)驗(yàn)技術(shù)等問題的制約[21]。因?yàn)榇嬖谝捉到?、遞呈效率偏低等缺點(diǎn)，IBDV DNA疫苗的應(yīng)用也受到制約[2,4]。此前學(xué)者曾用免疫刺激復(fù)合物 (ISCOM)[11]、雞白細(xì)胞介素 2[22-23]、雞白細(xì)胞介素18[24]與IBDV DNA疫苗配合使用，以促進(jìn)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，利用絲素蛋白、殼聚糖兩種生物高分子材料為壁材，以IBDV VP2/4/3 DNA疫苗為芯材，研制出了復(fù)合緩釋DNA微球疫苗，并驗(yàn)證了微球化IBDV DNA疫苗的保護(hù)及免疫原性，從血清抗 IBDV ELISA抗體及攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果來看，微球特別是絲素-殼聚糖復(fù)合微球?qū)C(jī)體免疫水平的提高有正促進(jìn)作用。徐懷英等以殼聚糖為囊材，新城疫病毒液為芯材，戊二醛為交聯(lián)劑，選擇適當(dāng)乳化系統(tǒng)制備新城疫微球疫苗，免疫SPF雞群后的MTT試驗(yàn)、血清lgG HI試驗(yàn)等檢測表明殼聚糖微球疫苗兼具了弱毒活疫苗和滅活苗的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的免疫效果[8-9]。Sun等對鴨皰疹病毒 glycoprotein C的DNA疫苗免疫研究中發(fā)現(xiàn)，殼聚糖載體能促進(jìn)質(zhì)粒DNA疫苗在鴨體多組織的分布[25]。這也與Tian等[1]和 Plapied等[26]的研究報(bào)道相一致。Friede等也認(rèn)為微球顆粒有緩釋抗原、減少注射劑量和促進(jìn)抗原遞呈至粘膜組織淋巴細(xì)胞的作用[27]。本研究結(jié)果證實(shí)微球化疫苗具有保護(hù)疫苗體內(nèi)運(yùn)輸穩(wěn)定性、控制包被抗原緩慢釋放、提高局部抗原濃度、延長抗原刺激時(shí)間和使抗體滴度維持較高水平的作用，而且還可保護(hù)抗原免受外界不良因素 (如有機(jī)溶劑、較低或較高pH環(huán)境、蛋白酶等) 的影響或破壞[28-29]。

殼聚糖微球具有無毒、生物相容性和可降解性，能夠增加腸道淋巴細(xì)胞中IgA、IgG水平和激活補(bǔ)體，刺激巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)吞噬能力，促進(jìn)粘膜中抗原遞呈細(xì)胞對抗原的攝取等優(yōu)點(diǎn)[30]；Aaharoff等的研究表明，在沒有其他佐劑的情況下，殼聚糖水溶液能增強(qiáng)由皮下注射蛋白抗原所產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[31]；Chirasak等也報(bào)道殼聚糖微球能有效遞呈抗原至 DC和 MΦ細(xì)胞[32]。但由于單純殼聚糖微球在水中易溶脹，造成荷載藥物的突釋[33]，而且殼聚糖制成的產(chǎn)品凍干后較硬，缺乏彈性[34-35]。來源于蠶絲脫膠后獲得的絲素蛋白，是一種天然高分子纖維蛋白。具有優(yōu)良的生物相容性、力學(xué)強(qiáng)度和柔韌性。絲素及其降解產(chǎn)物氨基酸對組織無毒性、無致敏和無刺激作用。絲素中含有豐富的酰胺基和少量羥基，可與殼聚糖形成氫鍵，破壞殼聚糖鏈本身之間的氫鍵，使殼聚糖中的一部分氨基得以自由。將絲素和殼聚糖這兩種天然高分子物質(zhì)共混，就可以克服單一組分的缺點(diǎn)。劉麗萍等以殼聚糖/絲素復(fù)合高分子為骨架材料研制了 5-Fu磁微球，研究發(fā)現(xiàn)其在藥物的緩釋和靶向定位方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值[36]；張幼珠等以消炎痛藥物為芯料，通過復(fù)凝聚法制備再生絲素蛋白-殼聚糖包藥微球、單凝聚法制備殼聚糖包藥微球，經(jīng)比較形貌、粒徑、包囊率、釋藥率等質(zhì)量指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，絲素-殼聚糖包藥微球成囊，包囊率高，藥物釋放效果更好[33]。張文元等對SF/CS形成的復(fù)合材料體外研究發(fā)現(xiàn)，SF/CS共混材料具有良好的細(xì)胞相容性，對BMSC細(xì)胞無毒，是組織工程中很有應(yīng)用前景的一種材料的研究[37]。本研究將絲素蛋白與殼聚糖共混制備的復(fù)合微球DNA疫苗，免疫效果也表現(xiàn)更佳；與前人[37-38]研究結(jié)果相吻合。這種功能可能一方面與雙層膜微球球壁增厚，以及雙層膜間層間所具有的緩沖室功能有關(guān)[33]；另一方面也與絲素蛋白具有抗腫瘤、免疫刺激等功能有關(guān)[39]。

本研究利用了戊二醛和 Na2SO4兩種交聯(lián)劑，盡管都可以形成微球，但從DNA活性檢測上發(fā)現(xiàn)前者對DNA活性影響很大，這可能與戊二醛交聯(lián)時(shí)與包封的DNA疫苗發(fā)生共價(jià)結(jié)合有關(guān)[40]；而在適量Na2SO4環(huán)境下，陰離子與殼聚糖所荷的正電荷發(fā)生乳化-離子交聯(lián)，制備微球DNA疫苗中，不影響 DNA活性。類似的還有用 TPP[41]等陰離子試劑發(fā)生離子交聯(lián)的原理來制備微球的報(bào)道。微球的形成及粒度大小的均勻度與工作條件 (如鹽溶液濃度、DNA疫苗濃度、操作溫度和攪拌速度) 密切相關(guān)；各材質(zhì)質(zhì)量配比顯著影響微球形態(tài)和形成過程，這使得通過可控性調(diào)節(jié)各種材料濃度、配比以改變微球的顯微結(jié)構(gòu)，最終獲得達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)的微球成為可能。但這些變量因素也降低了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)條件稍微改變就會(huì)使微球結(jié)構(gòu)改變，加之制備材料無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更增加了實(shí)驗(yàn)的難度。建立穩(wěn)定高效的微球疫苗工藝需要更多的細(xì)致工作，譬如對不同條件下微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)、釋藥速度、累積釋放率、保存條件、保存時(shí)間和免疫試驗(yàn)途徑等尚需進(jìn)一步研究?？傮w而言，隨著今后安全、靶向、控釋、緩釋型微球佐劑的研究的不斷深入，微球化技術(shù)有望在疫苗、藥物等領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。致謝：感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所陳柳、倪征老師在動(dòng)物試驗(yàn)方面給予的大力支持，感謝何麗華、沈衛(wèi)鋒、陳金娥在動(dòng)物攻毒和淋巴細(xì)胞檢測中提供的幫助。

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