屬級(jí)芯片篩查技術(shù)在馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬檢測(cè)中的應(yīng)用

張永江，辛言言，朱水芳，鄧叢良

1 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100029 2 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 101312

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬 (Pospiviroid) 屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科 (Pospiviroidae)，根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì) (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) 第九次分類報(bào)告，該屬包括菊花矮化類病毒(Chrysanthemum stunt viroid, CSVd)、柑橘裂皮類病毒 (Citrus exocortis viroid, CEVd)、金魚花潛隱類病毒 (Columnea latent viroid, CLVd)、血莧類病毒1 (Iresine viroid 1, IrVd-1)、墨西哥心葉茄類病毒 (Mexican papita viroid, MPVd)、馬鈴薯紡錘塊莖類病毒 (Potato spindle tuber viroid, PSTVd)、辣椒小果類病毒 (Pepper chat fruit viroid, PCFVd)、番茄頂縮類病毒 (Tomato apical stunt viroid, TASVd)、番茄褪綠矮縮類病毒 (Tomato chlorotic dwarf viroid, TCDVd) 及番茄雄性株類病毒 (Tomato planta macho viroid,TPMVd) 等10種類病毒[1]。該屬類病毒可侵染馬鈴薯、番茄、菊花及柑橘等多種重要的經(jīng)濟(jì)作物，并可通過種子及苗木迅速擴(kuò)散傳播，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-6]。近年來，該屬新的類病毒種不斷被鑒定，從2007年的8種 (CSVd、CEVd、CLVd、IrVd-1、MPVd、PSTVd、TASVd和 TCDVd) 增加到 2011年的 10種 (新增PCFVd和 TPMVd)；新的寄主也不斷被報(bào)道，如TASVd在2010–2012年間報(bào)道的新增寄主就有藍(lán)花茄Lycianthes rantonnetii、扭管花Streptosolen jamesonii、木曼陀羅屬Brugmansiasp.、素馨葉白英Solanum jasminoides及夜香樹屬Cestrumsp.等[7-9]；新發(fā)生的國(guó)家和地區(qū)也不斷增加，如TASVd的分布已從2003年首次報(bào)道的突尼斯迅速擴(kuò)散到了目前的奧地利、芬蘭、印度尼西亞、以色列、意大利、科特迪瓦、塞內(nèi)加爾、荷蘭、比利時(shí)、德國(guó)、法國(guó)及斯洛文尼亞[10-12]等國(guó)家。上述 3種“新”情況表明，該屬類病毒發(fā)現(xiàn)及傳播擴(kuò)散速度較以往大大增加，因而馬鈴薯等相關(guān)產(chǎn)業(yè)所面臨的危險(xiǎn)也將大大增加。為了盡早檢測(cè)到植物中的類病毒，防止其傳播擴(kuò)散，需要有效的技術(shù)來作為支撐。

現(xiàn)有的檢測(cè)方法如指示植物法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核酸斑點(diǎn)雜交法及RT-PCR法等都是針對(duì)該屬特定類病毒種的特異性檢測(cè)技術(shù)，在上述3種“新”情況下，這些特異性檢測(cè)技術(shù)將會(huì)延緩發(fā)現(xiàn)新類病毒的速度，也會(huì)增大檢測(cè)的強(qiáng)度；同時(shí)，很多寄主受侵染后會(huì)無癥狀表現(xiàn)，增加了特異性檢測(cè)的難度，漏檢的可能性非常大。為了解決這個(gè)問題，可以采用廣譜性篩查技術(shù)。廣譜性篩查技術(shù) (Broad spectrum screening techniques, BSST) 是目前流行的一類技術(shù)，如用于免疫學(xué)檢測(cè)的屬級(jí)抗體技術(shù)、用于分子生物學(xué)檢測(cè)的科或?qū)偌?jí)引物及屬級(jí)兼容性探針芯片技術(shù)等。這類技術(shù)往往具備某類病原物較高分類單元上的鑒定特征，因而具有較高的兼容性，可以對(duì)科或?qū)僦凶儺惔笄易儺愇稽c(diǎn)多的病原物進(jìn)行鑒定；特別是對(duì)于科或?qū)賰?nèi)可能出現(xiàn)的新種，具有較強(qiáng)的發(fā)現(xiàn)能力；同時(shí)，這類技術(shù)具有高通量的特點(diǎn)，一次樣品反應(yīng)可檢測(cè)到科或?qū)賰?nèi)已知和未知的病原物；這些特點(diǎn)使得該類技術(shù)可以大大提高新發(fā)病原物預(yù)報(bào)式篩查的效率，從而提前發(fā)現(xiàn)可能的危險(xiǎn)性病原物，如 Zhang等[13]建立的植物病毒屬級(jí)寡核苷酸芯片可以有效篩查到樣品中的新病毒，表明了這類篩查技術(shù)的實(shí)用性。

為了彌補(bǔ)目前特異性檢測(cè)技術(shù)的不足，提高 3種“新”情況下篩查馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬類病毒的能力，本文開展了該屬篩查芯片技術(shù)的研究，著重解決具備屬級(jí)鑒定特征芯片探針的獲得及其有效性驗(yàn)證的問題，初步建立了該類病毒屬屬級(jí)水平上的篩查芯片體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CSVd及TPMVd陽性材料來自美國(guó)ATCC(ATCC-PV-105，ATCC-45052)。

9N隨機(jī)引物為Invitrogen公司產(chǎn)品；納米磁珠檢測(cè)試劑盒來源由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局植物實(shí)驗(yàn)室提供；ExTaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNasin為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；CbcScript酶為AMBION公司產(chǎn)品；RNA及DNA純化試劑盒購(gòu)自MN公司。

1.2 RT-PCR反應(yīng)

根據(jù)NCBI中發(fā)表的序列，分別設(shè)計(jì)CSVd及TPMVd的種簡(jiǎn)并性全長(zhǎng)擴(kuò)增引物如表1。

總RNA提取：稱取100 mg樣品置于研缽中，加入適量的研磨液，用研磨棒充分研磨，使樣品均勻分散。將研磨后的樣品轉(zhuǎn)入離心管，5 000 r/min離心5 min。取100 μL離心上清于1.5 mL離心管中，再加入適量納米磁珠和1倍體積的結(jié)合液，上下顛倒充分混勻，室溫放置5 min。磁分離后棄上清，用200 μL清洗液清洗2?5次。加入50 μL洗脫液，緩慢抽吸均勻，室溫放置2?5 min后，磁分離，小心吸取上清液至新的離心管中進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

反轉(zhuǎn)錄：體系 20 μL，DEPC-H2O 10 μL、dNTPs 1 μL、下游引物 2 μL (20 μmol/L)、RNA模板 1 μL (200 ng/μL)；70 ℃反應(yīng) 5 min，冰上放置5 min；加入M-MLV酶5×緩沖液 4 μL、M-MLV酶 1 μL、RNA 酶抑制劑 1 μL，42 ℃反應(yīng) 1 h。

PCR擴(kuò)增：即在 0.2 mL的反應(yīng)管中加入cDNA 產(chǎn)物 2 μL、上游引物 0.5 μL (20 μmol/L)、下游引物 0.5 μL (20 μmol/L)、dNTPs 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、PCR緩沖液2 μL及DEPC-H2O 14 μL，然后按照PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 CSVd和TPMVd RT-PCR引物Table 1 Primers used for RT-PCR of CSVd and TPMVd

1.3 芯片體系

探針設(shè)計(jì)步驟如下：

1) 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBI)及國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)(ICTV)數(shù)據(jù)庫(kù)下載類病毒屬全基因組及核酸序列數(shù)據(jù)。

2) 分別使用類病毒全基因組序列和全部核酸序列設(shè)計(jì)探針。使用全部核酸序列時(shí)需進(jìn)行篩選，去除小于250 bp長(zhǎng)度的核酸序列。并使用NCBI的BLASTN對(duì)核酸序列去冗余，即如果某核酸序列 90%以上長(zhǎng)度與其他序列有 95%相似度，則刪除此序列。

3) 從 NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)下載全部植物mRNA序列數(shù)據(jù)、全部植物病毒基因組序列數(shù)據(jù)，作為探針設(shè)計(jì)的特異性數(shù)據(jù)庫(kù)。

4) 使用BLASTN聯(lián)配類病毒屬內(nèi)序列，以5個(gè)堿基作為間隔，連續(xù)提取所有40 bp的核酸序列，對(duì)選取的核酸序列進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為GC含量在 40%與 60%之間、單個(gè)核苷酸含量不大于 50%、沒有多于 4個(gè)核苷酸的連續(xù)重復(fù)及不形成多于6個(gè)核苷酸的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

5) 使用BLASTN將通過步驟4) 篩選的序列與步驟 3) 得到的特異性數(shù)據(jù)庫(kù)以及非此類病毒屬的其他所有植物類病毒核酸序列進(jìn)行特異性比對(duì)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為聯(lián)配序列長(zhǎng)度乘以相似性小于25 bp，并且無20 bp以上的完全吻合序列匹配。

6) 使用BLASTN將通過步驟5) 篩選的探針序列與本類病毒屬的所有類病毒序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為聯(lián)配序列長(zhǎng)度乘以相似性大于34 bp，且有連續(xù)15 bp的序列匹配。滿足此標(biāo)準(zhǔn)的序列，即為可以檢測(cè)到相應(yīng)類病毒的探針。

7) 使用維也納大學(xué)理論化學(xué)研究所(Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna)開發(fā)的RNAcofold程序計(jì)算探針與相應(yīng)類病毒序列結(jié)合的自由能及自身形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能。

8) 將步驟5) 得到的探針序列進(jìn)行排序，排序標(biāo)準(zhǔn)依次為探針對(duì)本類病毒屬所有類病毒的覆蓋率、探針與本類病毒屬序列結(jié)合總自由能、探針與本類病毒屬病毒序列結(jié)合總相似度、探針與特異性數(shù)據(jù)庫(kù)非特異結(jié)合相似度及探針形成自身RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能。

9) 將步驟5) 得到的探針去冗余，去掉重復(fù)探針，使得探針之間最大重復(fù)長(zhǎng)度不超過25 bp。重復(fù)的探針依步驟8) 的標(biāo)準(zhǔn)排序，只保留最佳的探針。此步驟得到的探針即為非重復(fù)的特異性探針。

10) 按步驟 8) 的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)步驟 9) 得到的探針進(jìn)行排序，依排序結(jié)果依次選擇探針，使本類病毒屬每個(gè)類病毒序列至少有3個(gè)探針對(duì)應(yīng)。選擇時(shí)，如果某些類病毒序列已經(jīng)達(dá)到 3個(gè)探針對(duì)應(yīng)，則對(duì)其他未被選擇的探針的排序，優(yōu)先考慮對(duì)其他未達(dá)到 3個(gè)探針對(duì)應(yīng)的類病毒序列的覆蓋率，之后再按照步驟8) 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排序。如果經(jīng)過步驟9) 無法達(dá)到本類病毒屬每個(gè)類病毒序列至少 3個(gè)探針對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，則在步驟 3) 降低序列保守性標(biāo)準(zhǔn)，重新設(shè)計(jì)，依此循環(huán)直到所有類病毒序列都有3個(gè)探針對(duì)應(yīng)。如果無法從保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針，或類病毒屬內(nèi)序列無保守區(qū)域，則使用所有類病毒序列全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)探針。探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與步驟4) 到步驟9) 相同。

樣品標(biāo)記、芯片雜交與洗滌方法均按照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。芯片數(shù)據(jù)分析時(shí)，探針的信號(hào)值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值。信噪比為圖像對(duì)應(yīng)點(diǎn)內(nèi)所有信號(hào)值的中位值與背景值中位值的比值。樣品中若至少一條探針的信號(hào)值≥600且信噪比≥3，判為陽性 (為Pospiviroid類病毒侵染)；探針的信號(hào)值＜600且信噪比＜2，判為陰性 (不為Pospiviroid類病毒侵染)；其余情況判為可疑，需重復(fù)驗(yàn)證。

1.4 芯片探針有效性驗(yàn)證

分別取CSVd及TPMVd的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1.3的方法進(jìn)行標(biāo)記、雜交及檢測(cè)，分析芯片探針的有效性。

1.5 芯片與RT-PCR靈敏度比較實(shí)驗(yàn)

將 CSVd總 RNA (200 ng/μL) 進(jìn)行 10倍梯度稀釋后用作模板，分別按照1.2和1.3的方法進(jìn)行芯片與RT-PCR檢測(cè)，比較兩者的靈敏度。

表2 寡核苷酸探針Table 2 Nucleotide probes

2 結(jié)果與分析

2.1 探針設(shè)計(jì)與芯片制備

采用生物信息學(xué)方法分析 Pospiviroid類病毒的核苷酸序列，根據(jù)設(shè)定的探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，獲得了19條40單體單元 (Monomerie unit, mer)的屬級(jí)鑒定特征的寡核苷酸探針 (表 2)。將寡核苷酸探針通過芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制到醛基基片上制備芯片。每條探針重復(fù)5次，矩陣為10×12。芯片包括4個(gè)部分：芯片固定陽性質(zhì)控Hex，雜交陽性質(zhì)控 PC，雜交陰性質(zhì)控 NC，其他位點(diǎn)為檢測(cè)探針 (圖1)。

圖1 芯片矩陣圖 (10×12)Fig. 1 Microarray construction (10×12).

2.2 探針有效性驗(yàn)證

應(yīng)用CSVd及TPMVd的樣品對(duì)芯片探針進(jìn)行驗(yàn)證，雜交結(jié)果如圖2及圖3所示。圖2中1#、3#、9#探針及圖 3中 1#、3#、4#、18#探針的信號(hào)值均大于600，信噪比均大于3，達(dá)到陽性結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)，說明本研究建立的芯片雜交體系能夠在樣品檢測(cè)中獲得有效的探針信號(hào)點(diǎn)，可以對(duì)樣品中是否含有該屬類病毒進(jìn)行判斷。圖2中的8#探針雖然具有肉眼可見的信號(hào)，且其信噪比大于3，但由于其信號(hào)值小于600，因而判為可疑點(diǎn)，在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè) (表3)。

2.3 芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果

CSVd總 RNA按 101、102及 103梯度稀釋后進(jìn)行cDNA合成、Klenow酶標(biāo)記和雜交，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)芯片進(jìn)行洗滌掃描。結(jié)果如圖 4所示，其中對(duì)照Hex、PC和NC雜交符合預(yù)期效果；而樣品雜交結(jié)果則隨著稀釋梯度的增大，探針信號(hào)強(qiáng)度越來越小；103稀釋梯度僅有9號(hào)探針信號(hào)達(dá)到陽性探針判斷的標(biāo)準(zhǔn)，因此所建立的芯片的靈敏度閾值大約是103。具體陽性探針信號(hào)值及信噪比見表4。

2.4 RT-PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果

CSVd總 RNA 按 100、101、102及 103梯度稀釋后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果表明可從陽性材料中擴(kuò)增出約354 bp的特異性目標(biāo)條帶。隨著總RNA稀釋倍數(shù)的增大，可以觀察到明顯的濃度梯度譜帶，稀釋梯度限點(diǎn)為103(圖5)。

圖2 菊花矮化類病毒樣品雜交Fig. 2 Hybridization using CSVd.

圖3 番茄雄性株類病毒樣品雜交Fig. 3 Hybridization using TPMVd.

表3 芯片探針有效性驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Results of microarray probes efficency validation

圖4 芯片靈敏度結(jié)果Fig. 4 Sensitivity test of microarray.

表4 芯片靈敏度結(jié)果Table 4 Results of microarray sensitivity

圖5 RT-PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Sensitivity test of RT-PCR. 1： 100 dilution; 2：101 dilution; 3： 102 dilution; 4： 103 dilution; M： marker DL2000.

3 討論

足夠量的標(biāo)記產(chǎn)物是芯片雜交時(shí)獲得足夠強(qiáng)度雜交信號(hào)的重要環(huán)節(jié)。選擇何種標(biāo)記策略，需要根據(jù)樣品中病原物含量的多寡及病原物基因組二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度等因素來確定，目前主要有 3種標(biāo)記方式：隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得標(biāo)記的 cDNA作為標(biāo)記產(chǎn)物；隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄后特異性引物PCR獲得標(biāo)記的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)記產(chǎn)物；特異性引物RT-PCR獲得標(biāo)記的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)記產(chǎn)物[14]。其中以第一種標(biāo)記方式為最好，可以使芯片具有更強(qiáng)的實(shí)用性。為此，本文最初采用第一種標(biāo)記策略來獲取標(biāo)記產(chǎn)物，但得到的產(chǎn)物與芯片雜交后沒有獲得雜交信號(hào) (結(jié)果未顯示)，這種狀況與的研究結(jié)果相同[15]，可能是類病毒基因組復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)所致。由于本研究的重點(diǎn)在于驗(yàn)證所獲得的屬級(jí)探針的有效性，故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用了特異性引物擴(kuò)增來獲得標(biāo)記產(chǎn)物的策略；為了增加芯片的實(shí)用性，需要進(jìn)一步研究更簡(jiǎn)便有效的標(biāo)記方式。

Supported by：National Department Public Benefit Research Foundation (No. 201110035).

Corresponding author：Shuifang Zhu. Tel/Fax： +86-10-64896608; E-mail： zhushf020420@gmail.com

受質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (No. 201110035) 資助。

芯片靈敏度的高低決定了芯片在實(shí)際應(yīng)用中的效果。一般情況下，對(duì)于同一種樣品，RT-PCR的檢測(cè)靈敏度要高于芯片檢測(cè)靈敏度；也有兩者持平的情況；甚至后者高于前者的情況[16-17]，這種情況的影響因素較多，比如瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中凝膠的厚度、電泳緩沖液的新鮮程度或電泳電壓的高低等都可能會(huì)影響到PCR的檢測(cè)靈敏度，使其檢測(cè)的靈敏度要比理論上的靈敏度低。在本文中，因?yàn)槭褂玫氖穷惒《痉N的簡(jiǎn)并引物，獲得的PCR產(chǎn)物的特異性要比隨機(jī)引物或科屬簡(jiǎn)并引物獲得的PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)，產(chǎn)物量也大，與芯片雜交時(shí)獲得的雜交信號(hào)的質(zhì)量就高，信號(hào)就強(qiáng)，兩者的檢測(cè)靈敏度持平，均可檢測(cè)到 10–3稀釋梯度的樣品總RNA。對(duì)于特異性檢測(cè)芯片來說，其特異性與靈敏度一樣，也是建立有效芯片檢測(cè)技術(shù)的重要一面。不過，因?yàn)楸疚慕⒌男酒菑V譜性的篩查芯片，而非特異性的檢測(cè)芯片，因此，信號(hào)點(diǎn)的探針對(duì)應(yīng)的類病毒種類不一定絕對(duì)是探針序列來源的類病毒種類；是何種類病毒最終要由序列測(cè)定來確定。所以，本文沒有應(yīng)用其他屬的類病毒進(jìn)行芯片的特異性研究，這并不影響該技術(shù)的建立和使用。

目前對(duì)于 Pospiviroid類病毒的檢測(cè)方法有生物學(xué)測(cè)定[18]、聚丙烯酰胺凝膠電泳[19]、Northern 雜交[20-21]、RT-PCR[22-24]及 RT-PCRELISA[25]等，這些方法適用于樣品中已知類病毒的特異性檢測(cè)，對(duì)于潛在的未知類病毒則無法進(jìn)行有效檢測(cè)；且一次反應(yīng)最多檢測(cè)幾種類病毒。下一代測(cè)序技術(shù) (Next generation sequencing technologies, NGST) 的發(fā)展為潛在未知類病毒的有效檢測(cè)提供了一個(gè)選擇。通過小RNA庫(kù)的構(gòu)建及深度測(cè)序，NGST可以鑒定樣品中已知和未知的類病毒種類。Li等應(yīng)用小RNA深度測(cè)序技術(shù)分析了受感染的番茄樣品，發(fā)現(xiàn)其中感染了馬鈴薯紡錘塊莖類病毒、柏平縷瓜花葉病毒和一種新的馬鈴薯Y病毒屬病毒[26]。不過，NGST費(fèi)用昂貴、數(shù)據(jù)量龐大且分析復(fù)雜。為了彌補(bǔ)上述技術(shù)的缺陷，本研究根據(jù)Pospiviroid類病毒的序列設(shè)計(jì)了19條40 mer的具有該屬鑒定特征的探針，制備相應(yīng)芯片后以CSVd及TPMVd樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明探針有效性良好，具有較高的靈敏度，初步建立了Pospiviroid芯片篩查技術(shù)，為該屬類病毒的篩查探索了一種有效和有前景的技術(shù)體系；對(duì)今后在植物類病毒的檢測(cè)鑒定中應(yīng)用廣譜篩查技術(shù)作為快速和高通量篩查方法具有借鑒意義。

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