非離子表面活性劑對生物丁醇發(fā)酵的影響

侯同剛，張躍冬，陳秀芳，關(guān)靜，牟新東中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 中國科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實驗室，山東 青島 266101

兩次石油危機(jī)以后，能源供應(yīng)安全問題引起世界各國的廣泛關(guān)注。發(fā)展生物能源，促進(jìn)能源供應(yīng)多元化，是保障國家能源安全的重要舉措。生物丁醇是生物能源的重要組成部分，它比生物乙醇更有優(yōu)越性[1-2]：生物丁醇的蒸汽壓力更低，與汽油混合時對雜質(zhì)水的寬容度更大，腐蝕性更小，與現(xiàn)有的生物燃料相比，能夠與汽油達(dá)到更高的混合比而無需對車輛進(jìn)行改造。

然而傳統(tǒng)的丙酮-丁醇 (ABE) 生產(chǎn)工藝中，由于存在反饋抑制作用，丁醇的終濃度一般不超過2.0 wt%，后期分離需要大量能耗，這就影響了該過程的經(jīng)濟(jì)性，限制了生物丁醇的大規(guī)模生產(chǎn)[3]。為提高該工藝經(jīng)濟(jì)性，許多研究針對發(fā)酵菌體的抗性基因改造以及產(chǎn)物的在線分離展開[4-6]。

四川大學(xué)李偉佳等[7]采用紫外線誘變處理，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)王風(fēng)芹等[8]利用低溫等離子體和亞硝基胍先后處理，都得到了高產(chǎn)的誘變菌株。另外，利用基因工程的手段進(jìn)行菌種的改造，也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。例如Mermelstein等[9]通過構(gòu)建了含有新基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicumATCC 824后，丙酮、丁醇和乙醇的產(chǎn)量分別提高了 95%、37%和 90%，而且轉(zhuǎn)化菌株更加穩(wěn)定。在生產(chǎn)工藝的改進(jìn)方面，Ishizaki等[10]以甲基化的天然棕櫚油為萃取劑進(jìn)行在線分離，可將 47%左右的總?cè)軇┹腿〕鰜?，葡萄糖的消耗率可?62%提高到83%，丁醇產(chǎn)量由15.4 g/L提高到20.9 g/L。楊立榮等[11]從13種有機(jī)物中選出了油醇和混合醇作為萃取劑，最終總?cè)軇舛瓤蛇_(dá)到33.63 g/L。Ezeji等[12]研究了在線氣提分離工藝，與間歇發(fā)酵相比，溶劑產(chǎn)率和產(chǎn)量分別能夠提高200%和118%。Ezeji等[13]發(fā)現(xiàn)，與氣提整合的發(fā)酵可以利用199 g/L的葡萄糖，可以產(chǎn)生69.7 g/L的總?cè)軇Ａ硗?，與膜蒸餾[14-15]、滲透汽化[16-19]等耦合的在線分離手段研究也有報道。但到目前為止，提高該過程經(jīng)濟(jì)性的研究仍處于實驗室階段。

隨著分離手段的不斷進(jìn)步，表面活性劑在生物發(fā)酵中的應(yīng)用也越來越多。有研究發(fā)現(xiàn)，在液液萃取過程中添加少量的表面活性劑會影響到萃取效率，一般認(rèn)為表面活性劑處于兩個液相界面處，可以促進(jìn)或者阻止液液界面溶質(zhì)的交換。Pursell等[20]研究了液液萃取過程中表面活性劑和生物質(zhì)之間的相互作用。結(jié)果表明，不同的表面活性劑對傳質(zhì)的影響不同，極性表面活性劑可以促進(jìn)界面的傳質(zhì)，而非極性表面活性劑一般會降低界面處的溶質(zhì)傳遞。當(dāng)發(fā)酵菌體表面吸附有帶負(fù)電荷的表面活性劑時，表面活性劑會影響界面的穩(wěn)定性。

表面活性劑不僅能影響到液液的傳質(zhì)過程，還能夠通過在細(xì)胞表面的吸附來調(diào)節(jié)細(xì)胞的表面性質(zhì)。有研究顯示不動桿菌自身產(chǎn)生的生物表面活性劑能夠促進(jìn)菌株在有機(jī)污染物液滴上的吸附。Hua等[21]報道，一株南極假絲酵母表面的疏水性會在其自身產(chǎn)生的表面活性劑作用下增強(qiáng)。也有表面活性劑降低菌體表面疏水性的報道，Arino等[22]考察了一株銅綠假單胞菌表面性質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的憎水性在甘油培養(yǎng)基中發(fā)酵 200 h后開始減弱并最終下降到原來的一半。Ahimou等[23]認(rèn)為表面活性劑分子極性端易吸附到弱疏水性的細(xì)胞膜表面，而非極性端易吸附到強(qiáng)疏水性細(xì)胞膜表面，從而伸向細(xì)胞外側(cè)的分子基團(tuán)使得細(xì)胞表面的親疏水性能與原來的相反。除此之外，很多發(fā)酵過程中會遇到泡沫問題，除機(jī)械除泡外，一般通過添加表面活性劑作為消泡劑使用，通常也會對發(fā)酵產(chǎn)量帶來不利的影響[12]。

在上述的發(fā)酵工藝過程中，相比于發(fā)酵液或萃取劑而言，表面活性劑的添加量非常小，一般都低于1%。但即使是如此少量的添加，也會對菌體產(chǎn)生一定的毒害作用[24]，因此未見關(guān)于添加大量表面活性劑的研究報道。由于丁醇對菌體的毒害作用主要來自于丁醇在細(xì)胞膜內(nèi)的溶解，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性受到影響，膜上的酶遭到破壞。如果表面活性劑可以吸附到細(xì)胞膜上并改變其表面性質(zhì)，則可能會影響丁醇的毒害作用。另外，表面活性劑形成的膠束對丁醇會有一定的增溶作用。基于上述考慮，本文考察了高添加量的小分子非離子表面活性劑對生物丁醇發(fā)酵過程的影響，重點(diǎn)研究了表面活性劑的增溶效果和對菌體表面性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、醋酸銨、對氨基苯甲酸、維生素B1、維生素 H、醋酸鈉、硫酸銨、7水合硫酸鎂、1水合硫酸錳、7水合硫酸亞鐵、氯化鈉、油醇等藥品均為分析純，購自上海溶劑廠；硝酸鈷、硫氰酸銨、二氯甲烷、十六烷等購自上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；非離子表面活性劑吐溫、司盤系列購自上海申宇醫(yī)藥化工有限公司，純度高于99%。

1.2 微生物和發(fā)酵條件

本實驗采用常用的丙酮丁醇發(fā)酵菌種丙酮丁醇梭菌ATCC 824。菌體以孢子懸浮液的形式存于 4 ℃冰箱內(nèi)。開始培養(yǎng)前，將孢子懸浮液在80 ℃保溫10 min，然后接種到蛋白胨/葡萄糖/酵母提取物培養(yǎng)基中。活化后的菌體接種到MP2培養(yǎng)基中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，得到的菌體用于發(fā)酵。每升MP2培養(yǎng)基的主要成分和含量為：7水合硫酸鎂 0.2 g，1水合硫酸錳0.01 g，7水合硫酸亞鐵0.01 g，氯化鈉0.01 g，維生素B1 0.01 g，維生素H 0.1 g，磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀各0.5 g，硫酸銨2.0 g以及少量醋酸鈉，溶于蒸餾水中。

1.3 毒性測試

利用搖瓶實驗測試溶劑或表面活性劑的生物相容性。每個搖瓶中將活化好的菌體接種到葡萄糖基生長培養(yǎng)基中，搖瓶具塞密閉，搖床轉(zhuǎn)速低于100 r/min，定期利用針頭放氣，以免炸裂。37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，取10 mL發(fā)酵液添加到25 mL已滅菌的并添加一定量葡萄糖的MP2培養(yǎng)基中，然后加入5 mL溶劑或表面活性劑，在搖床下培養(yǎng)6 h，這時菌體處于快速生長階段。接下來的24 h中，利用水取代法檢測每個搖瓶的產(chǎn)氣量。

1.4 吐溫80的菌體吸附及菌體表面性質(zhì)測試

菌體在含有 6%葡萄糖作為碳源的 MP2培養(yǎng)基中培養(yǎng)100 h，10 000 r/min離心10 min。收集到的菌體用MP2培養(yǎng)基清洗3次后，再用MP2培養(yǎng)基溶解。每5 mL菌體懸浮液與5 mL含有吐溫80的MP2溶液混合，在100 r/min的水浴振蕩器中振蕩90 min。然后10 000 r/min離心分離菌體和水相，檢測水相中吐溫80的濃度，通過吸附前后濃度的變化，計算吸附量，空白實驗用于計算吸附在搖瓶壁的菌體數(shù)量。

離心后得到的菌體進(jìn)一步用改進(jìn)的 BATH(Bacterial adhesion to hydrocarbons) 法測定其親疏水性質(zhì)[25]。菌體用MP2培養(yǎng)基清洗兩次后再由MP2培養(yǎng)基重新分散，利用紫外分光光度計在400 nm下檢測其吸光度。4 mL菌體懸浮液與1 mL十六烷混合于10 mL離心管內(nèi)，旋渦振蕩1 min后，在室溫下自然分層。菌體疏水性通過式 (1) 計算。

其中Rbath表示基于空白的疏水性改變的百分比，Aini表示初始菌體懸浮液的吸光度，不含表面活性劑，Amix表示與表面活性劑混合后水相的吸光度。

1.5 分析方法

發(fā)酵液中丁醇含量由氣相色譜 (GC Hewlett) 測定，色譜帶有自動進(jìn)樣系統(tǒng)，火焰離子檢測器。毛細(xì)管柱 (2 m×2 mm packed with 100/120 Carbopack B AW/6.6 wt% PEG20M;Superco Inc., Bellefonte, Pa.)，箱內(nèi)溫度以每分鐘16 ℃程序升溫從100 ℃至210 ℃，進(jìn)樣器和檢測器溫度都為 200 ℃，載氣為氮?dú)?，每分?0 mL流量。

丁醇在含有表面活性劑的溶液中，其濃度由頂空氣相色譜測定 (GC, Varian model 3700,USA)，頂空瓶為 20 mL，在 37 ℃下平衡30 min，配置丁醇濃度從1 g/L到20 g/L。取2 mL溶液放入頂空瓶中，做 3次平行，用色譜圖峰面積取3次平均值。

膠束增溶通過兩個參數(shù)表征，增溶量χ和膠束水分配系數(shù)K。χ為單位質(zhì)量膠束能夠增溶的溶質(zhì)質(zhì)量?？梢愿鶕?jù)膠束增溶公式如式 (2)：

式中St表示溶質(zhì)總?cè)芙舛龋琒w表示在含有膠束的水溶液中，溶質(zhì)在水中的溶解度，Cs表示溶液中表面活性劑的濃度，cmc表示臨界膠束濃度。

K表示溶質(zhì)在膠束內(nèi)和膠束外的比例，如式 (3)：

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑的生物相容性

在ABE發(fā)酵過程中，同時會產(chǎn)生氫氣和二氧化碳等氣體，氣體的產(chǎn)量可以作為菌體活性的一個指標(biāo)[26]。圖 1顯示了添加不同種類溶劑時，發(fā)酵后的氣體產(chǎn)量變化。從圖中可以看到，油醇樣品在發(fā)酵初始的6 h (空白) 和發(fā)酵終了(斜線)，其產(chǎn)氣量都要低于相同條件下的空白樣品。實驗表明，在發(fā)酵初始6 h中，生成的丁醇濃度低于4 g/L，這一濃度不會對菌體產(chǎn)生抑制。添加油醇的樣品在這一時期產(chǎn)氣量低于空白，則說明油醇本身對菌體有一定的毒害作用。相應(yīng)的含有表面活性劑的所有樣品，在發(fā)酵初始的6 h和整個發(fā)酵結(jié)束后，其產(chǎn)氣量都不低于空白。這說明表面活性劑對菌體不僅沒有毒性，而且會解除部分由丁醇產(chǎn)生的毒性作用。

圖1 溶劑種類對丁醇發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響Fig. 1 Effect of different solvents on gas production of ABE fermentation. Horizontal： gas production in the first 6-hour. Slash： gas production when fermentation finished.

實驗以吐溫80為代表，考察了不同添加量對發(fā)酵的影響，見圖2。從圖中可見，隨著吐溫80添加量不斷提高，發(fā)酵氣體的產(chǎn)量與丁醇濃度變化趨勢相似。當(dāng)吐溫80添加量低于0.1 wt%時，氣體產(chǎn)量與丁醇濃度都低于空白；而當(dāng)吐溫80的添加量超過0.1 wt%時，氣體產(chǎn)量與丁醇濃度都隨著吐溫80的添加量增加而呈現(xiàn)上升趨勢，高于空白。這現(xiàn)象說明在低添加量下，吐溫80對菌體表現(xiàn)出毒性，而在高添加量下則沒有。

圖2 表面活性劑添加量對生物丁醇發(fā)酵的影響Fig. 2 Effect of surfactants amount on ABE fermentation.

這可能與吐溫 80的臨界膠束濃度有一定關(guān)系。吐溫80在25 ℃下，在水相中的臨界膠束濃度為0.14 wt%，如果溶液中存在丁醇等物質(zhì)時，其臨界膠束濃度會變小。可以認(rèn)為當(dāng)添加量為0.1 wt%時，吐溫80在水溶液中并沒有形成膠束。

上述實驗表明膠束的形成有利于緩解丁醇對菌體的毒害作用，而且高添加量的表面活性劑本身不表現(xiàn)出毒性作用。由于吐溫80的毒性轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在其臨界膠束濃度附近，有必要對吐溫80膠束的增溶作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 表面活性劑膠束的增溶作用

吐溫80可以形成膠束，并且對丁醇有一定的增溶作用。由于丁醇濃度比較低，而且實驗中使用的吐溫80為低分子表面活性劑，因此很難依照文獻(xiàn)的方法對膠束的增溶特性進(jìn)行表征。等式 (2) 變形可得：

St為丁醇在溶液中的真實濃度，該濃度可通過實驗準(zhǔn)確制備得到。當(dāng)St為一固定值時，該濃度下臨界膠束濃度cmc也會是一個固定值，根據(jù)等式 (4)，如果膠束增溶量χ不變，那么Sw和Cs就會呈現(xiàn)出線性關(guān)系。此時可以根據(jù)斜率值推算出該條件下的臨界膠束濃度。

為表征丁醇在吐溫80膠束中的增溶情況，本實驗利用頂空氣相色譜，通過氣相中丁醇的含量反推溶液中未被增溶的、游離的丁醇濃度，即水相中丁醇的濃度Sw。其前提假設(shè)為增溶到膠束內(nèi)部的丁醇不會產(chǎn)生蒸汽壓。另外，根據(jù)拉烏爾定律，將表面活性劑的增加帶來的蒸汽壓下降計算在內(nèi)，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 不同表面活性劑添加量對增溶效果的影響Fig. 3 Effect of surfactants amount on butanol’s solubilization.

從圖3中可見，當(dāng)吐溫80添加量較少時，其濃度與水相中的丁醇濃度比較符合直線關(guān)系，根據(jù)公式 (4)，可得到χ值和cmc值。當(dāng)丁醇濃度較低時，得到cmc的值為12 g/L，與文獻(xiàn)報道接近。隨著初始丁醇濃度增加，cmc值變小，而χ值增大。cmc是表面活性劑非常重要的參數(shù)之一，表面活性劑在溶液中的濃度到達(dá)及超過該值后，其分子或離子自動締合成的膠體大小的聚集體質(zhì)點(diǎn)微粒，cmc值會受到溶液中醇類分子的影響而變化，有報道證明cmc在丁醇存在時會下降，與我們的實驗結(jié)果相吻合。χ值的變化應(yīng)該是因為膠束形成后，隨著表面活性劑的進(jìn)一步增加，其膠束形狀不再均一，而是出現(xiàn)各種不同形狀的膠束，從而導(dǎo)致丁醇在其中增溶量發(fā)生變化。從圖3中還可以看到，χ值非常小，這表明單位質(zhì)量的膠束能增溶的丁醇質(zhì)量非常有限。例如，初始丁醇濃度10.43 g/L時，添加50 g/L的表面活性劑僅僅能使丁醇的濃度較低0.48 g/L。因此，圖1和圖2中丁醇的增加量大部分并沒有增溶進(jìn)入膠束的內(nèi)部。

2.3 表面活性劑在菌體表面的吸附

吐溫 80形成的膠束對丁醇的增溶量非常少，因此高添加量下吐溫80對菌體的減毒作用不僅僅是膠束增溶的影響。圖 4顯示了表面活性劑在菌體細(xì)胞表面的吸附以及對細(xì)胞表面疏水性的影響。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吐溫80添加量少于0.1 wt%時，其相對疏水性隨著濃度的變化會發(fā)生劇烈變化。而當(dāng)吐溫 80濃度高于0.1 wt%時，其親疏水性質(zhì)基本不發(fā)生變化。這一趨勢與吐溫80在細(xì)胞表面的吸附趨勢一致，因此可以認(rèn)為表面活性劑的親疏水性的變化是由于吐溫80的吸附造成的。

圖4 吐溫80在菌體表面的吸附及疏水性變化Fig. 4 Adsorption of Tween 80 on cell surface and its effect to surface hydrophobicity.

吐溫80對菌體表面親疏水性的影響，與其對菌體的毒性作用非常類似。有報道表明，丁醇對菌體的毒性主要是由于其對細(xì)胞膜以及細(xì)胞膜上的酶造成的影響導(dǎo)致的，且毒性的大小與其化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系不大，主要在于其在細(xì)胞膜上的溶解濃度。當(dāng)吐溫80濃度較低時，與丁醇在細(xì)胞膜內(nèi)的溶解類似，其分子中的疏水基團(tuán)會溶解于細(xì)胞膜，這時吐溫80和丁醇共同作用于細(xì)胞膜，從而表現(xiàn)出毒害作用。隨著吐溫 80濃度進(jìn)一步增加，溶液中除游離吐溫80分子外，還形成了膠束，形成的膠束親水基團(tuán)外露，這些膠束會與已經(jīng)吸附在細(xì)胞膜上的吐溫80的親水基團(tuán)相互作用，從而減輕了吸附膠束的毒害作用。從圖4中可以看到，隨著吐溫80平衡濃度的提高，有機(jī)相中吸附的菌體量增加，即菌體表面的疏水性增強(qiáng)了，但由于 BATH法測試本身需要使用有機(jī)溶劑，該測試方法影響到了游離表面活性劑及膠束的活動，因此無法得到菌體表面親疏水性受膠束影響的變化，而只能得到菌體吸附單層表面活性劑后的疏水性質(zhì)。這也說明了圖4中，吐溫80添加量較高時其親疏水性質(zhì)基本不變的原因。

2.4 不同發(fā)酵條件對批式發(fā)酵丁醇終點(diǎn)濃度的影響

圖5 不同發(fā)酵條件對批式發(fā)酵丁醇終點(diǎn)濃度的影響Fig. 5 ABE batch fermentation under different conditions.

在上述研究基礎(chǔ)上，利用5 L發(fā)酵罐，對比了有表面活性劑和沒有表面活性劑的發(fā)酵結(jié)果。初始葡萄糖濃度為100 g/L，發(fā)酵過程持續(xù)超過100 h，結(jié)果見圖5。從圖中可以看到，發(fā)酵終了，沒有添加表面活性劑的空白樣中丁醇濃度只能達(dá)到8 g/L左右，這可能是由于長期低溫保藏，導(dǎo)致了菌種退化。而同樣的菌體，添加表面活性劑的樣品，其丁醇濃度超過了16 g/L，證明了表面活性劑對丁醇的促進(jìn)作用。從圖 5中可以看到，帶有表面活性劑的樣品，其丁醇的產(chǎn)生要遲于空白樣品。一方面由于表面活性劑在菌體表面的吸附，可能會影響到細(xì)胞對葡萄糖、水等物質(zhì)的可及性，另一方面也可能影響到丁醇向胞外的分泌?？傊?，由表面活性劑在菌體表面的吸附對菌體的影響是比較復(fù)雜的，需要進(jìn)一步深入的研究。

另外，受表面活性劑添加的影響，發(fā)酵過程中丁酸、乙酸、丙酮、乙醇等的濃度隨發(fā)酵時間的變化趨勢與未添加表面活性劑的樣品也稍有不同 (圖中未標(biāo)出)，其變化趨勢與丁醇類似。但發(fā)酵結(jié)束后，產(chǎn)物丁醇、丙酮、乙醇三者的質(zhì)量比與未添加表面活性劑的樣品基本一致。實驗所用的吐溫系列表面活性劑溶于水，而司盤80和司盤85都是不溶于水的，在實驗中發(fā)現(xiàn)，該類表面活性劑的少量添加會在溶液表面形成幾個小油滴。隨著發(fā)酵進(jìn)行，直到發(fā)酵結(jié)束，覺察不到油滴數(shù)量的減小，而相應(yīng)的樣品產(chǎn)氣量也都高于空白。綜上可以認(rèn)為表面活性劑并沒有參與到代謝過程。

3 總結(jié)

丙酮丁醇發(fā)酵過程中，非離子小分子表面活性劑添加量低時會降低丁醇的濃度，而添加量較高時則可以提高丁醇濃度。丁醇濃度的提高不僅僅是因為表面活性劑形成的膠束對丁醇的增溶作用，實驗結(jié)果表明，單位質(zhì)量的膠束中丁醇的量非常少。吐溫80分子可以吸附到菌體表面，改變菌體表面的親疏水性，這可能是其增加丁醇產(chǎn)量的主要原因。

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