聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中污染的預(yù)防與對策

牛玉森

【摘要】目的：討論聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中污染的預(yù)防與對策，保證日常臨床檢驗基因擴(kuò)增的質(zhì)量。方法：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)。 結(jié)果：嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，防止假陽性，假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 污染；對策

Prevention of pollution and Countermeasures in the process of polymerase chain reaction NiuYuSen

Wu Weishi people's hospital office （ 733000）

【Abstract】Objective Discussion on the prevention of pollution and Countermeasures inpolymerase chain reaction process， ensure the quality of routine clinicalexamination of gene amplification.Methods of polymerase chain reaction technology. Results according to strict operation regulations， prevent false positive， false negative results.

【Key words】Polymerase chain reaction ；pollution； countermeasures

【中圖分類號】R51 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2014）04-0018-02

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR技術(shù)。該技術(shù)可將極微量的靶DNA特異的擴(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力。被廣泛的應(yīng)用于感染性病原體，如HBV、HCV各種性病病原體等的檢測。該反應(yīng)的最大特點是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，操作復(fù)雜，所以在操作過程中常有污染發(fā)生，即使極少量的污染也會造成假陽性，稍有差錯就會出現(xiàn)假陰性。

1 污染原因

1.1 污染原因無論哪種情況，污染是由于操作者操作不干凈引起的。

1.1.1 來自實驗材料污染：如重組克隆的D.A、或者來自同一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物污染。主要是由于PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

1.1.2 標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

1.1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/m1），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。

1.1.4 還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。

1.1.5 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染。在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。

2 防止污染的預(yù)防與對策

2.1 合理分隔實驗室。在理想的條件下，PCR應(yīng)該在一間單獨的實驗室內(nèi)進(jìn)行操作，較為實際的選擇是在實驗室中為設(shè)置PCR劃出特定的區(qū)域：將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)；②PCR反應(yīng)液制備區(qū)；③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)；④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用。實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的D.A或R.A。

2.2 吸樣槍。吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

2.3 預(yù)混和分裝PCR試劑。必須使用衛(wèi)生部或國家權(quán)威機構(gòu)指定廠家生產(chǎn)的試劑和未過期的試劑。所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

2.4 防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

2.5 選擇質(zhì)量好的Eppendorf管。以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，在打開含有PCR所用試劑的微量離心管前，先把離心管放置在超凈工作臺的離心機中進(jìn)行短暫離心（10s）。這可以使液體沉在底部并減少手套和移液裝置污染的可能性。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

2.6 擴(kuò)增儀的設(shè)置要符合要求，取樣器刻度準(zhǔn)確，減少PCR循環(huán)次數(shù)。只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。

2.7 D.A污染源的去除可通過用254nm的紫外線特定的試劑（去除d.TP和H20的緩沖液）來實現(xiàn)。紫外線照射也可用于小的裝備如：支架、移液器等的外表面去除污染。工作區(qū)、微量離心管的非金屬表面和PCR儀可用弱漂白粉溶液去污染。

3 總結(jié)

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新型PCR儀器及相應(yīng)試劑、試劑盒的不斷出現(xiàn)，PCR技術(shù)的實驗方法也變得越來越簡便、快捷、實用，已普及到各基層醫(yī)院，廣泛地用于感染性病原體的檢測，如HBV、HCV等的臨床檢測。由于操作人員缺乏對核酸擴(kuò)增檢驗技術(shù)完整的了解以及缺乏質(zhì)量保證措施，導(dǎo)致部分實驗室結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性的出現(xiàn)。所以操作者必須熟練掌握技術(shù)，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，防止假陽性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生而誤導(dǎo)臨床。