磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展及其在肝臟生理和病理機(jī)制中的應(yīng)用

衣泰龍，田苗苗，楊曉明，徐平

綜 述

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展及其在肝臟生理和病理機(jī)制中的應(yīng)用

衣泰龍1,2，田苗苗2，楊曉明1,2，徐平1,2

1 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京蛋白質(zhì)組研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

蛋白質(zhì)磷酸化是最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式。由于蛋白質(zhì)的磷酸化形式可以被磷酸酶和磷酸激酶進(jìn)行可逆的調(diào)控，所以在眾多的生命活動(dòng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的磷酸化修飾起著重要的調(diào)控作用，因此對(duì)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化修飾的系統(tǒng)研究對(duì)于揭示生命科學(xué)的奧秘顯得十分重要。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)軟件以及磷酸化肽段富集方法的發(fā)展，利用質(zhì)譜對(duì)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化修飾研究的技術(shù)逐漸成熟。肝臟作為人體最重要的代謝和免疫器官，深入研究肝臟細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化修飾形式對(duì)于理解其功能具有重要指導(dǎo)意義。目前，迅速發(fā)展的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到肝臟功能的生物學(xué)研究中。這些研究加深了人們對(duì)肝臟的生理及病理狀態(tài)的分子生物學(xué)機(jī)制的了解。本文綜述了當(dāng)前磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在肝臟中的研究。

蛋白質(zhì)磷酸化，肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組，磷酸化肽富集，定量蛋白質(zhì)組，生物信息學(xué)

磷酸化修飾是蛋白質(zhì)最主要的翻譯后修飾形式之一。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、發(fā)育、分化和疾病的發(fā)生等眾多過(guò)程，對(duì)生命活動(dòng)起著非常重要的調(diào)控作用。例如：線蟲(chóng)種系的發(fā)育[1]、神經(jīng)突觸囊泡的運(yùn)輸[2]、組織和器官特性的維持[3-4]、癌癥的發(fā)生與發(fā)展[5-6]等幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程和蛋白質(zhì)的磷酸化修飾有著重要的關(guān)聯(lián)。因此蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究對(duì)于揭示生命的奧秘，疾病的診斷和治療等有著非常重要的意義。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一部分內(nèi)容，其研究技術(shù)歸功于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括質(zhì)譜儀器的發(fā)展、樣品的分離、定量技術(shù)的發(fā)展以及鑒定軟件的開(kāi)發(fā)。由于磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽段的特殊性，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的研究需要一些特殊的手段。首先從化學(xué)計(jì)量的角度來(lái)講，在生物體內(nèi)磷酸化蛋白的豐度低于非磷酸化蛋白，因而在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)磷酸化肽段的信號(hào)會(huì)受到非磷酸化肽段信號(hào)的掩蓋，因此在通常情況下很難直接用質(zhì)譜檢測(cè)到磷酸化肽段。為此，人們發(fā)展了一系列的磷酸化蛋白或磷酸化肽段特殊的染色方法、標(biāo)記方法和富集方法，用于高靈敏度和特異性的磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)。此外，由于修飾的磷酸基團(tuán)的存在，磷脂鍵的不穩(wěn)定性使得磷酸化肽段在常規(guī)的碰撞誘導(dǎo)解離 (Collision induced association, CID) 檢測(cè)時(shí)易產(chǎn)生信號(hào)很強(qiáng)的中性丟失峰，難以有效鑒定。為應(yīng)對(duì)這種局面，不同的碎裂方式得以嘗試，并取得了良好的結(jié)果。再輔以一系列針對(duì)磷酸化肽段鑒定和位點(diǎn)確定的質(zhì)譜軟件，使得磷酸化蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)日趨成熟，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的典范。

成熟的磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)促進(jìn)了生命科學(xué)研究的深入開(kāi)展。肝臟是生物體重要的功能器官，負(fù)責(zé)機(jī)體的代謝、供能、體溫維持和機(jī)體免疫等功能。隨著磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和成熟，肝臟相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究逐漸增多。本文就磷酸化肽的分離和富集策略、磷酸化肽鑒定軟件開(kāi)發(fā)、磷酸化肽碎裂模式探索以及肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 磷酸化肽的富集分離方法

在早期的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通常使用雙向凝膠電泳技術(shù) (2-DE) 根據(jù)磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白等電點(diǎn)的差異進(jìn)行樣品分離，再使用32P標(biāo)記和磷酸化蛋白的特異染色鑒定磷酸化蛋白[7]。但是這兩種策略都由于雙向凝膠電泳技術(shù)本身的限制，難以滿(mǎn)足大規(guī)模、高通量、高效率的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要。

近來(lái)，適用于大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的多肽樣品分離和磷酸化肽高效富集方法爆炸式產(chǎn)生，促進(jìn)了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的快速發(fā)展。

磷酸化修飾肽段上的磷酸基團(tuán)的存在，使得磷酸化肽與非磷酸化肽所帶的電荷不同，所以最常用的樣品初級(jí)分離方法是離子交換分離。為充分分離、簡(jiǎn)化或富集特定的組分，強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜 (Strongcation exchange chromatography，SCX)[8]、強(qiáng)陰離子交換色譜(Strong anion exchange chromatography，SAX)[9]、多維液相色譜 (Multidimensional liquid chromatography)[10]、親水相互作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)[11]、靜電排斥-親水性相互作用色譜(Electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography，ERLIC)[12]等多樣的分離策略得到了深入研究和廣泛應(yīng)用。但離子交換色譜往往柱效比較低，且分離后的樣品需要進(jìn)行再次的脫鹽操作。而近幾年來(lái)發(fā)展的耐高pH的反相液相色譜 (High pH RP) 因其擁有高柱效，分離后的組分不需進(jìn)行再次脫鹽等優(yōu)勢(shì)，并且和蛋白質(zhì)組學(xué)上樣品檢測(cè)使用的LC-MS/MS中的反相液相色譜的正交性較好而逐漸被應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中。

在磷酸化肽段的富集方面，適于抗體富集法[13]、固相金屬離子親和色譜 (Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)[14]、金屬氧化物親和色譜 (Metal oxide affinity chromatography，MOAC)[15]等的親和介質(zhì)和富集技術(shù)得到了有效發(fā)展。由于這些方法通常都兼具磷酸化肽段分離和富集的作用，并具有一定的互補(bǔ)性，形成了豐富并各具特色的組合。而抗體、IMAC和MOAC等方法由于對(duì)磷酸化肽富集的高特異性，使得在大多數(shù)情況下將其他幾種方法用作磷酸化樣品的初分離，并形成了以親疏水性和離子交換等為分離方式的IMAC富集方法[16-17]、以離子交換為分離方式的MOAC的富集方法[8]以及抗體富集與IMAC[18]和MOAC[19]結(jié)合等眾多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的高覆蓋。下面分別對(duì)磷酸化肽富集和分離的方法進(jìn)行分析。

1.1 磷酸化肽的富集

現(xiàn)在常用的磷酸化肽的富集方法主要是IMAC和MOAC[20]。但是這兩種方法均存在著非特異性吸附和吸附能力不足的缺陷。此外，針對(duì)磷酸化修飾的酪氨酸殘基的抗體，也是磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的富集材料[18]。表1中系統(tǒng)比較了這3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

在IMAC研究中，由于酸性基團(tuán) (如羧基等) 的存在，高豐度非磷酸化肽造成的非特異性吸附阻礙了磷酸化肽段的富集。Ficarro通過(guò)酯化反應(yīng)來(lái)封閉樣品中磷酸基團(tuán)以外的其他酸性基團(tuán)，這在一定程度上提高了IMAC富集的特異性。但由于該方法副反應(yīng)產(chǎn)物的存在又限制了此方法的使用[14]。

除了非特異性吸附之外，吸附能力的大小也是一個(gè)影響富集效果的重要因素。系統(tǒng)比較不同的吸附離子后發(fā)現(xiàn)在Fe3+、Ga3+、Al3+、Zn2+、Cu2+、ZrO2+等諸多離子中，F(xiàn)e3+的特異性最高，可達(dá)到93%。在此基礎(chǔ)上還建立了以Fe3+為螯合介質(zhì)的富集磷酸化肽段的優(yōu)化流程[16-21]。我國(guó)科學(xué)家在磷酸化肽段的富集方面也做了大量的創(chuàng)新性工作。如中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的鄒漢法團(tuán)隊(duì)對(duì)Fe3+、Ti4+和Zr4+富集磷酸化肽段的能力進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)Ti4+和Zr4+對(duì)磷酸化肽的吸附性和特異性都要比Fe3+的好[22-27]，這為磷酸化肽段富集技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

表1 不同類(lèi)型的磷酸化肽富集方法的比較Table 1 Comparison of different types of phosphopeptides enrichment methods

除了金屬離子的選擇外，固相金屬親和介質(zhì)的選擇也是影響IMAC方法富集效率的重要因素。亞氨基二乙酸 (IDA)[14]、次氮基三乙酸(NTA)[17,28]是常用的金屬螯合親和介質(zhì)。但是對(duì)于不同的吸附離子，最佳的金屬螯合親和介質(zhì)是不同的。例如：在以Fe3+為吸附離子時(shí)磷酸化富集中利用NTA (富集效率：93%) 作介質(zhì)的效果要優(yōu)于IDA (富集效率：7.1%)，而以ZrO2+為吸附離子時(shí)，以IDA為金屬螯合親和介質(zhì)時(shí)的富集效率 (37%) 要高于以NTA為金屬螯合親和介質(zhì)時(shí)的富集效率 (7.1%)[21]。最近鄒漢法團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)以共價(jià)鍵連接到載體上的磷酸基團(tuán)作為配基的IMAC (Ti4+，Zr4+作為吸附離子) 在磷酸化肽富集的特異性和吸附能力方面都要比傳統(tǒng)的Fe3+-IMAC的效果好[25-26]。

富集手法對(duì)磷酸化肽段的富集效果也有影響。Yue等發(fā)現(xiàn)通過(guò)多次富集可以增加大約18%的磷酸化肽段的鑒定數(shù)量。在富集的磷酸化肽段中，多磷酸化的肽段會(huì)優(yōu)先被富集，但是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸修飾的磷酸化位點(diǎn)比例在3次富集中并沒(méi)有明顯差異[29]。

在MOAC富集磷酸化肽段的研究中，TiO2是最常用的金屬氧化物。此外，硅?氧化鑭等新的氧化物材料也得到了嘗試[30]。與IMAC相似，酸性氨基酸的吸附也是影響磷酸化肽段富集特異性的一個(gè)重要因素。而在富集樣品前使用二羥基苯甲酸 (DHB)[31-32]、天冬氨酸[33]和谷氨酸[20,34]等，可有效降低介質(zhì)對(duì)富含酸性氨基酸肽段的非特異性吸附。除了對(duì)酸性氨基酸的非特異性吸附之外，Kanshin等還發(fā)現(xiàn)TiO2會(huì)對(duì)含谷氨酰胺和天冬酰胺肽的肽段也產(chǎn)生特異吸附，通過(guò)加入游離的天冬酰胺和谷氨酰胺可以降低80%非磷酸化肽的豐度[35]。

由于納米材料具有較大的相對(duì)表面積，最近也被應(yīng)用到了IMAC和MOAC中[20]。另外，特殊的納米顆粒也為磷酸化肽的吸附提供了特殊的環(huán)境，使得磷酸化肽的結(jié)合速度也得到了提高。這些特點(diǎn)使得納米材料在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[36]。然而，這些納米材料的應(yīng)用并沒(méi)有改變?cè)瓉?lái)的吸附原理，仍然是通過(guò)金屬氧化物[37]或金屬離子[38-42]對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集。具有相似原理的高吸附能力的包被在石墨烯上的聚多巴胺 (Polydopamine)在磷酸化肽的富集方面也得到了應(yīng)用[43]。

抗體在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中也得到了很好地應(yīng)用。目前雖然市場(chǎng)上有針對(duì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等針對(duì)磷酸化修飾肽段的抗體，但前兩者的特異性差，在一定程度上限制了抗體富集技術(shù)在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)上的應(yīng)用。而針對(duì)酪氨酸磷酸化修飾肽段抗體的特異性好，可用于酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究[44-46]。

因?yàn)椴煌椒ㄔ诟患姿峄臅r(shí)有很高的互補(bǔ)性[47]，所以出現(xiàn)了一系列通過(guò)不同方法組合進(jìn)行磷酸化肽富集的研究。例如，Tsai等通過(guò)Ga3+和Fe3+先后富集，發(fā)現(xiàn)各有41%和51%特異性富集的磷酸化肽[48]。

1.2 磷酸化肽的分離策略

為了降低磷酸化肽的復(fù)雜度，磷酸化肽的預(yù)分離顯得很重要。理論上，可用于蛋白質(zhì)組學(xué)的降低肽段復(fù)雜度的方法也可以用于磷酸化肽的分離。表2對(duì)不同分離原理的方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)比較。

由于磷酸化肽所帶的電荷數(shù)比未修飾的肽段少一個(gè)電荷，所以通過(guò)離子交換的方法進(jìn)行的分離也起到了對(duì)磷酸化肽富集的作用[16]。同時(shí)，磷酸基團(tuán)作為親水基團(tuán)還改變了磷酸化肽的親疏水性。所以根據(jù)親疏水性進(jìn)行的分離方法同樣也具有磷酸化肽富集的效果[11-12,17]。

SDS-PAGE作為常用的蛋白質(zhì)分離方法，可根據(jù)分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。然而，磷酸化蛋白質(zhì)更多地出現(xiàn)在高分子量區(qū)域[49]。而且，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的載樣量相對(duì)較小，所以現(xiàn)在很少用這種方法。

不論是根據(jù)親疏水性還是通過(guò)離子交換對(duì)肽段進(jìn)行分離，雖然都有效地降低了磷酸化肽的復(fù)雜度，但磷酸化肽本身并沒(méi)有得到很好的分離。而且有研究比較發(fā)現(xiàn)，在相同機(jī)時(shí)的情況下，通過(guò)二維分離可以比一維分離多鑒定40%的磷酸化肽段[50]；Mohammed實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，在樣品量足夠 (不同的樣品，所需的起始材料的量不同) 的情況下，通過(guò)三維液相分離鑒定的磷酸化位點(diǎn)比通過(guò)二維液相分離鑒定的磷酸化位點(diǎn)多了29% (多鑒定4 092個(gè)磷酸化位點(diǎn))[51]。

最近Carr實(shí)驗(yàn)室通過(guò)高pH反相液相色譜分離，并采取每隔24個(gè)組分進(jìn)行合并的方式，實(shí)現(xiàn)了磷酸化肽的平均分配并且單次實(shí)驗(yàn)最多鑒定到了超過(guò)22 000個(gè)磷酸化位點(diǎn)[17]。

表2 不同原理的蛋白/肽段分離方法的比較Table 2 Comparison of protein/peptide separation methods based on different separation principle

2 磷酸化肽段的鑒定

2.1 磷酸化肽段的碎裂和鑒定方式

目前常用的磷酸化肽段碎裂方式主要有碰撞誘導(dǎo)解離 (Collision induced dissociation，CID)、電子捕獲解離 (Electron capture dissociation, ECD)、電子轉(zhuǎn)運(yùn)解離 (Electron transfer dissociation, ETD) 和高能碰撞解離(Higher energy collision dissociation, HCD) 等。表3對(duì)3種碎裂方式在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)比較。

CID因是絕大多數(shù)質(zhì)譜儀的標(biāo)準(zhǔn)配置，具有掃描速度快、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此和蛋白質(zhì)鑒定一樣，在磷酸化蛋白質(zhì)組中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，在CID碎裂時(shí)易發(fā)生磷酸基團(tuán)的中性丟失，導(dǎo)致碎裂不完全，因而二級(jí)譜圖的質(zhì)量差。盡管中性丟失基團(tuán)可以作為磷酸化肽段的標(biāo)志，還可通過(guò)激發(fā)中性丟失離子的第三級(jí)碎裂 (MS3或pseudo-MS3碎裂) 增加鑒定可靠性[52-53]。但是，這種方式并不能提高磷酸化肽段的鑒定量，而且對(duì)于確定磷酸化位點(diǎn)的貢獻(xiàn)也比較小[54]。此外，通過(guò)CID進(jìn)行碎裂的過(guò)程中磷酸化基團(tuán)還易發(fā)生分子內(nèi)轉(zhuǎn)移，增加了鑒定的難度[55-56]。

為了解決CID碎裂過(guò)程中的中性丟失問(wèn)題，Zubarev和Kelleher發(fā)明的ECD和美國(guó)維杰尼亞大學(xué)Hunt實(shí)驗(yàn)室Coon等發(fā)明的ETD先后被用于磷酸化肽段的鑒定。這兩種碎裂模式均可使磷酸化肽中的磷脂鍵在碎裂過(guò)程中保持較好的完整性，二級(jí)譜圖質(zhì)量明顯提高，極大地增加了磷酸化肽位點(diǎn)的可靠性[20]。Pandey實(shí)驗(yàn)室比較了ETD和CID在磷酸化肽鑒定的效果，發(fā)現(xiàn)用ETD比用CID多了40%肽段碎裂離子，由此多鑒定了60%的磷酸化肽[57]。

HCD由于高能碰撞，碎裂更加充分，可以產(chǎn)生更多的碎裂離子。這使得二級(jí)譜圖的質(zhì)量更高，可得到可信度更高的鑒定結(jié)果[58]，因而在磷酸化肽段鑒定中逐漸得到了更多的應(yīng)用。盡管如此，Gygi實(shí)驗(yàn)室通過(guò)‘back-to-back’的方法嚴(yán)格地比較了CID和HCD在鑒定磷酸化肽段中的效果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)HCD碎裂得到的譜圖的XCorr、Δ Cn和Ascore值比用CID碎裂得到的高，但是由于HCD的掃描速度比CID慢，因此在相同的條件下，CID可得到更多的磷酸化肽段的鑒定[18]。與ETD相比，Kuster實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大規(guī)模合成磷酸化肽發(fā)現(xiàn)HCD的鑒定能力超過(guò)了ETD[59]。隨著儀器的發(fā)展，掃描速度的進(jìn)一步加快，可以預(yù)見(jiàn)HCD會(huì)在磷酸化肽的鑒定中具有更廣的應(yīng)用前景。

除了上述幾種碎裂方式外，Mohammed實(shí)驗(yàn)室新近發(fā)展的電子轉(zhuǎn)移高能碰撞裂解(Electron-transfer/higher-energy collision dissociation, EThcD) 可實(shí)現(xiàn)肽段的ETD和HCD的級(jí)聯(lián)碎裂，使得磷酸化肽可以產(chǎn)生c-、z-、b-和y-離子。這些更為豐富的肽段碎裂離子在磷酸化位點(diǎn)的確定中具有更好的指示作用，顯現(xiàn)了優(yōu)于HCD和ETD的性能[60]。

表3 常用磷酸化肽段碎裂鑒定方法的比較Table 3 Comparison of commonly used phosphopeptides dissociation methods

2.2 磷酸化肽的鑒定和位點(diǎn)確定軟件的開(kāi)發(fā)

磷酸化肽段的鑒定中常用的軟件有Sequest、Mascot和Mann實(shí)驗(yàn)室新近開(kāi)發(fā)的Andromeda等[61]。Thermo公司組合了Sequest和Mascot等搜索引擎，形成了ProteomeDiscoverer，并在蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定中也得到了應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)，中國(guó)科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所的賀思敏團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了pFind系列軟件，并在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中得到了測(cè)試，顯示了良好的性能[62]。值得注意的是，除Andromeda和pFind為免費(fèi)搜索引擎外，其他的都需要付費(fèi)才能使用。

在磷酸化肽的鑒定中，位點(diǎn)的確定是一個(gè)難題。目前主要的位點(diǎn)校正軟件主要有Gygi實(shí)驗(yàn)室用在Sequest搜索結(jié)果上的Ascore[63]、Mann實(shí)驗(yàn)室用于Mascot和Andromeda引擎檢索結(jié)果后的PTM score[8,59,61]、Thermo公司Proteome Discoverer中的phosphoRS和用于多級(jí)碎裂的PhosphoScore[64]以及Mascot Delta Score[59,65]等。D-score是一個(gè)最近開(kāi)發(fā)的用于磷酸化位點(diǎn)校正的軟件，可以用于Mascot、OMSSA和X!Tandem等的鑒定結(jié)果[66]。目前對(duì)于不同的軟件還沒(méi)有比較研究的結(jié)果發(fā)表。

最近利用大規(guī)模合成的磷酸化肽段評(píng)估質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，并比較了鑒定軟件Andromeda、Mascot以及磷酸基團(tuán)定位軟件MD score、PTM score和PhosphoRS的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以decoy的方法進(jìn)行質(zhì)控的時(shí)候，肽段鑒定結(jié)果的FDR和鑒定的磷酸化位點(diǎn)的FDR都有低估現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)這些軟件在鑒定等方面具有一定的互補(bǔ)性[59]。

3 定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

磷酸化蛋白質(zhì)組的定量與普通的蛋白質(zhì)組的定量類(lèi)似，都是直接通過(guò)肽段水平的定量實(shí)現(xiàn)的。所以，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)也都可以應(yīng)用于磷酸化的定量。但由于同一肽段不同位點(diǎn)磷酸化變化并不一定一致[8]，因此，磷酸化蛋白質(zhì)組的定量是蛋白質(zhì)具體肽段的定量值，而非來(lái)自同一個(gè)蛋白的不同肽段的定量值的整合。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能引入的誤差，如蛋白質(zhì)消化過(guò)程中的漏切、相同肽段可能存在的多個(gè)修飾位點(diǎn)的情況等都使得磷酸化位點(diǎn)的直接定量難度較大。因此研究具體的磷酸化位點(diǎn)的變化的時(shí)候需要人工仔細(xì)檢查。

已有的用于蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)，如SILAC、iTRAQ和TMT等均可以用于磷酸化定量。其中，iTRAQ和TMT等化學(xué)標(biāo)記定量結(jié)果通常會(huì)因諸多技術(shù)原因縮小了自然狀態(tài)的差異，盡管這種差異可通過(guò)MS3和氣相凈化(Gas-phase purification) 技術(shù)得以部分克服[67-68]，但是磷酸化研究中所用的起始材料量往往比較大，不僅化學(xué)標(biāo)記本身的成本是一個(gè)限制因素，而且至今還鮮有通過(guò)MS3和氣相凈化進(jìn)行定量的報(bào)道。最近，鄒漢法實(shí)驗(yàn)室通過(guò)還原二甲基化作用引入穩(wěn)定同位素的方法被用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究中[69]。但是引入的同位素保留時(shí)間的不一致可能會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性[70]。

在磷酸化研究中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間磷酸化修飾的相對(duì)變化是生物學(xué)研究中關(guān)注的主要內(nèi)容。除此之外，為了研究一個(gè)磷酸化位點(diǎn)在生物體內(nèi)的修飾與未修飾的比例，Gygi實(shí)驗(yàn)室通過(guò)還原二甲基化作用發(fā)展了一種研究磷酸化與未磷酸化比例的定量方法[71]。

4 日趨成熟的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

隨著磷酸化肽段的富集、分離和鑒定技術(shù)的日趨成熟和質(zhì)譜儀器的快速發(fā)展，產(chǎn)生的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)規(guī)模逐漸增大，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)已趨于成熟。例如，Gygi實(shí)驗(yàn)室通過(guò)研究不同的小鼠組織和器官，共鑒定到了將近36 000個(gè)磷酸化位點(diǎn)[4]。Olsen通過(guò)研究小鼠的不同器官和組織，共鑒定到了31 480個(gè)位點(diǎn)[3]。這是當(dāng)前最大的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集。單次實(shí)驗(yàn)鑒定的數(shù)量也在不斷增多，并已經(jīng)超過(guò)20 000個(gè)位點(diǎn)[17]。與此同時(shí)，進(jìn)行磷酸化研究所需要的總樣品量也在減少。最近Zhou等用500 μg蛋白的消化產(chǎn)物鑒定到了13 681個(gè)磷酸化位點(diǎn)，3 mg蛋白消化產(chǎn)物鑒定到了18 055個(gè)磷酸化位點(diǎn)[51]。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)通過(guò)EDTA處理液相色譜系統(tǒng)的管路，可以降低金屬管路對(duì)磷酸化肽，尤其是多個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾的磷酸化肽的吸附，從而有效地提高了磷酸化肽段的覆蓋度[72]。

隨著對(duì)磷酸化研究的不斷深入，預(yù)測(cè)激酶底物的軟件iPGS[73]、構(gòu)建磷酸化信號(hào)通路的軟件Answer Set Programming[74]和Sorad[75]等得以成功開(kāi)發(fā)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息學(xué)工具的發(fā)展將為復(fù)雜的生命活動(dòng)規(guī)律的揭示提供有效手段[3,8,76]。

5 肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

肝臟涉及到食物的消化、能量的供應(yīng)、體溫的維持、免疫調(diào)節(jié)、解毒以及許多重要代謝中間體的合成等諸多功能，是高等生物機(jī)體內(nèi)新陳代謝最活躍的器官。肝臟生物學(xué)功能的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重的疾病，甚至死亡，因此肝臟的生理和病理研究長(zhǎng)期以來(lái)一直是健康醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)磷酸化參與了生物體內(nèi)幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程。這在肝臟生理和病理蛋白質(zhì)組學(xué)研究中也得到了充分的體現(xiàn)。

在肝臟疾病模型的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面，糖尿病是受到較多關(guān)注的方向。糖尿病與胰島素相關(guān)的信號(hào)通路密切相關(guān)，已有研究表明在胰島素刺激過(guò)程中，包括Akt和PI3K/mTOR在內(nèi)的超過(guò)5 000個(gè)磷酸化位點(diǎn)會(huì)發(fā)生修飾水平的變化[77]。因此磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)于揭示糖尿病的致病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。曾嶸實(shí)驗(yàn)室對(duì)早期發(fā)病階段的二型糖尿病肝臟線粒體進(jìn)行了包括磷酸化蛋白質(zhì)組在內(nèi)的多個(gè)層面的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[78]。Pshezhetsky實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)胰島素會(huì)引發(fā)囊泡運(yùn)輸、代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和基因表達(dá)等眾多過(guò)程的蛋白質(zhì)的磷酸化的變化[79]。Pagliarini實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)肥胖和二型糖尿病小鼠模型肝臟線粒體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)磷酸化在酮體生成過(guò)程中起著重要作用，并發(fā)現(xiàn)催化酮體生成的限速酶Hmgcs2 (S456)的磷酸化修飾可以提高其催化酮體生成的活性[80]。

肝臟也是重要的解毒器官。Dai實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)全氟十二酸會(huì)抑制胰島素信號(hào)通路，并推測(cè)脂質(zhì)體的升高抑制了糖原合酶的激酶的活性[81]。這一研究將為肝臟解毒的機(jī)制研究提供磷酸化修飾方面的基礎(chǔ)。但是因?yàn)檫@一研究只鑒定了1 443個(gè)磷酸化位點(diǎn)，所以深入的大規(guī)模的研究還有待開(kāi)展。

肝癌是威脅人類(lèi)健康的重大隱患。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中RAF/mitogenactiv atedprotein kinase (MAPK) /extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase (MEK)/ ERK (RAF/MEK/ERK) 等與磷酸化密切相關(guān)的信號(hào)通路通常處于活化狀態(tài)，這說(shuō)明蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制密切相關(guān)[82-83]。因此對(duì)于肝癌的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯得十分重要。目前以肝癌為模型的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究還比較少。鄒漢法實(shí)驗(yàn)室[68]定量比較研究了正常肝臟組織和肝癌組織的磷酸化差異，發(fā)現(xiàn)肝癌中ERK信號(hào)通路中眾多蛋白質(zhì)的磷酸化水平發(fā)生了變化，例如B-Raf的S729位點(diǎn)磷酸化水平上調(diào)了兩倍。Lee等[84]通過(guò)定量比較正常和肝癌細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組的差異，篩選并確定了潛在的肝癌生物標(biāo)志物。Mann實(shí)驗(yàn)室通過(guò)定量比較磷酸酶抑制劑對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞系Hepa1-6磷酸化影響，發(fā)現(xiàn)只有很少的磷酸化肽的修飾受到了明顯的影響。這也暗示著更有效的磷酸酶抑制劑需要用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的收集和制備中[19]。

肝臟生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律是理解肝臟功能及其調(diào)控的基礎(chǔ)，但至今這方面的研究也還比較少。Gygi實(shí)驗(yàn)室對(duì)小鼠肝臟磷酸化肽進(jìn)行了基序和位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)了直接與脯氨酸相鄰的基序、堿性基序、酸性基序和含有堿性氨基酸和酸性氨基酸的雙極性基序等，并且發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)更容易出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的羧基末端 (C端)[85]。這為預(yù)測(cè)和尋找激酶底物提供了依據(jù)，也為分析不同的磷酸化肽富集方法的偏好性提供了方法和工具。此外，Gygi實(shí)驗(yàn)室還分析了小鼠包括肝臟在內(nèi)的9個(gè)不同器官的磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)了3%的肝臟特異性的磷酸化位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了Mek2等在肝臟和肺等特異的磷酸化修飾[4]。在Gygi實(shí)驗(yàn)室之后，Olsen實(shí)驗(yàn)室也定量比較了包括肝臟在內(nèi)的不同器官和組織的磷酸化蛋白質(zhì)組的差異，發(fā)現(xiàn)糖原分解酶的酪氨酸位點(diǎn)在骨骼肌中被磷酸化，但是在肝臟中卻并沒(méi)有被磷酸化[3]。這為人們理解不同組織的生物學(xué)功能以及肝臟的磷酸化狀態(tài)提供了依據(jù)。Gygi實(shí)驗(yàn)室還用在低pH條件下還原二甲基化作用的定量標(biāo)記方法研究了禁食和重新喂食小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，并觀察到了RSK2在重新喂食2 h后被磷酸化激活等新的發(fā)現(xiàn)[70]。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的鄒漢法和華中科技大學(xué)的薛宇合作開(kāi)發(fā)了iGPS軟件，并對(duì)人肝臟激酶底物進(jìn)行了預(yù)測(cè)，產(chǎn)生了當(dāng)時(shí)最大的人類(lèi)肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集[73]。這一數(shù)字在2013年又被鄒漢法實(shí)驗(yàn)室的22 446個(gè)磷酸化位點(diǎn)更新[85]。

6 展望

運(yùn)動(dòng)是生命形式的本質(zhì)特征。生物體通過(guò)蛋白質(zhì)不同位點(diǎn)、不同翻譯后修飾形式或者同一類(lèi)型的不同結(jié)構(gòu)的翻譯后修飾實(shí)現(xiàn)信號(hào)的接受、傳遞、放大和效應(yīng)。因此蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)態(tài)變化研究將是在成熟的磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)基礎(chǔ)上的必然選擇。隨著翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的不斷成熟，不同的翻譯后修飾的串話研究正在成為研究熱點(diǎn)。目前在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，與磷酸化串話的翻譯后修飾的研究主要是泛素化、糖基化和乙酰化。

在磷酸化與乙酰化的串話研究中，Zhao實(shí)驗(yàn)室和Volchenboum實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物信息的方法預(yù)測(cè)乙?；苡锌赡芘c包括磷酸化在內(nèi)的眾多修飾有串話[87]；Bork實(shí)驗(yàn)室和Gavin實(shí)驗(yàn)室通過(guò)敲除兩個(gè)激酶和一個(gè)磷酸酶發(fā)現(xiàn)了磷酸化和乙?；揎椂及l(fā)生了變化，并推測(cè)了潛在的串話[88]。

除了與乙?；拇捴?，磷酸化與泛素化的串話也是研究的重點(diǎn)。Beltrao實(shí)驗(yàn)室和Krogan實(shí)驗(yàn)室整合了11種真核生物的磷酸化位點(diǎn)、泛素化位點(diǎn)和乙酰化位點(diǎn)，并發(fā)明了一種可以排列不同修飾的功能關(guān)聯(lián)優(yōu)先級(jí)的方法[89]。

此外，糖基化和磷酸化之間的串話是最近研究的比較多的另一種串話。Sze實(shí)驗(yàn)室通過(guò)同時(shí)研究鼠腎組織的蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)多能蛋白聚糖核心蛋白(Versican core protein) 和纖連蛋白 (Fibronectin)等可以同時(shí)被磷酸化和糖基化修飾，暗示了兩種修飾之間的串話[90]。Burlingame實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)鼠突觸進(jìn)行糖基化和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)激酶通常會(huì)被糖基化修飾，暗示著糖基化和磷酸化的串話是通過(guò)糖基化的修飾來(lái)調(diào)節(jié)激酶的活性實(shí)現(xiàn)的[91]。Yang實(shí)驗(yàn)室和Smitha實(shí)驗(yàn)室通過(guò)研究小鼠大腦的糖蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)很多發(fā)生糖基化的位點(diǎn)靠近已知的磷酸化位點(diǎn)，這也支持蛋白質(zhì)糖基化和磷酸化修飾之間的串話[92]。

此外，Bork實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了PTMcode數(shù)據(jù)庫(kù)，這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)包括了已知的和預(yù)測(cè)的磷酸化修飾等在內(nèi)的不同翻譯后修飾之間的功能的相互關(guān)系信息[93]。Nature Methods今年同時(shí)發(fā)表了兩篇研究磷酸化和泛素化等修飾之間串話研究方法的論文[17,28]，為眾多翻譯后修飾之間的串話的研究提供了思路。

目前對(duì)于肝臟尤其是肝癌的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的生物學(xué)研究還比較少。雖有研究表明肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中RAF/mitogenactivated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase (MEK)/ERK (RAF/MEK/ERK)磷酸化通路會(huì)發(fā)生失調(diào)，但是其磷酸化位點(diǎn)的研究尚不充分，所以對(duì)磷酸化位點(diǎn)的研究將會(huì)成為肝癌未來(lái)研究的主要方向。隨著磷酸化蛋白質(zhì)組研究的深入，產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)需要生物信息學(xué)來(lái)解決，因此生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用也將會(huì)成為磷酸化蛋白質(zhì)組研究中不可缺少的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。同時(shí)激酶抑制劑在肝癌發(fā)生或發(fā)展過(guò)程中對(duì)其磷酸化蛋白質(zhì)組的影響將會(huì)成為篩選抗癌藥物的有利手段。亞細(xì)胞器或者靶向的相互作用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究將會(huì)成為將來(lái)深入探討磷酸化作用機(jī)制的重要手段。隨著技術(shù)的成熟以及生物研究的需要，對(duì)肝臟的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究將會(huì)為揭示肝臟生物學(xué)的奧秘提供支持。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress and application of phosphoproteomics in the proteomics of liver pathological and physiological state

Tailong Yi1,2, Miaomiao Tian2, Xiaoming Yang1,2, and Ping Xu1,2
1 Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui, China 2 Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing Proteome Research Center, State Key Laboratory of Proteomics, Beijing 102206, China

The phosphorylation is one of most common protein post-translational modifications. The protein phosphorylation plays important roles in the life through the reversible process of phosphorylation and dephosphorylation by kinases and phosphatases. Systematical analysis of the phosphorylation state of proteins would greatly help to reveal the mystery of the life. Recently, with the development of mass spectrometer, bioinformatics sortwares and enrichment methods of phosphopeptides, phosphorylation stduy of orgnism proteins by mass spectrometer has become mature gradually. Liver is one of the most important metabolic and immune organs. In-depth study of protein phosphorylation in liver is of great importance to reveal its function. And booming phosphoproteomics has been applied into the study of liver, which has deepened the knowledge of molecular mechnism of its physiology and pathology states. Here, we review the recent progress on the research and development of phosphoproteomics and their application in liver proteomics study.

proteinphosphorylation, phosphoproteome of liver, enrichment of phosphopeptide, quantitative proteome, bioinformatics

December 27, 2013; Accepted: May 28, 2014

Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; Fax: +86-10-80705155; E-mail: xupingghy@gmail.com XiaomingYang. Tel: +86-10-66931424; Fax: +86-10-68212874; E-mail:xiaomingyang@sina.com

衣泰龍, 田苗苗, 楊曉明, 等. 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展及其在肝臟生理和病理機(jī)制中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 1004–1017.

Yi TL, Tian MM, Yang XM, et al. Progress and application of phosphoproteomics in the proteomics of liver pathological and physiological state. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1004–1017.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780), Beijing Natural Science Foundation (No. 5112012).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31070673, 31170780)，北京市自然科學(xué)基金 (No. 5112012) 資助。