金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-fve在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)

林景衛(wèi)，賈佳，鐘鳴，陳麗靜，李浩戈，郭志富，齊明芳，劉立俠，李天來(lái)

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-fve在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)

林景衛(wèi)1,2，賈佳2，鐘鳴2，陳麗靜2，李浩戈2，郭志富2，齊明芳1，劉立俠3，李天來(lái)1

1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866
2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866
3 東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024

為獲得穩(wěn)定來(lái)源并且具有生物學(xué)活性的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip-fve)，將fip-fve基因轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中進(jìn)行誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)。用PCR方法從金針菇子實(shí)體基因組DNA中擴(kuò)增fip-fve基因，連接至pPIC9構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve，從畢赤酵母基因組DNA中擴(kuò)增三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(pgap)，替換pPIC9-FIP-fve上乙醇氧化酶啟動(dòng)子 (paox1) 構(gòu)建組成型表達(dá)載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。將線性化的兩種表達(dá)載體用PEG法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)組氨酸缺失培養(yǎng)基篩選和酵母菌落PCR鑒定后進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，重組Fip-fve在以甲醇 (1%，V/V) 為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)型表達(dá)4 d達(dá)到最高，粗蛋白表達(dá)量為158.2 mg/L，在以葡萄糖 (10%) 和甘油 (1%，V/V) 為碳源進(jìn)行組成型分別在表達(dá)第4天和第5天達(dá)到最高，粗蛋白分別為46.3 mg/L和29.5 mg/L。SDS-PAGE及Western blotting證明重組Fip-fve已正確表達(dá)，血細(xì)胞凝集活性檢測(cè)初步證明重組Fip-fve具有良好生物學(xué)活性。

金針菇,免疫調(diào)節(jié)蛋白,畢赤酵母,組成型表達(dá)

金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip-fve) 是上個(gè)世紀(jì)末從金針菇子實(shí)體中提純的一種小分子功能蛋白質(zhì)，隸屬于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip) 家族[1]。迄今為止，多種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白已被發(fā)現(xiàn)，包括靈芝、松杉靈芝、草菇、黑芝和紫芝等[2-5]，該家族蛋白由110個(gè)左右氨基酸組成，分子量為12–13 kDa，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。Fip-fve由114個(gè)氨基酸組成，分子量為12.7 kDa，與第一個(gè)已知的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白——LZ-8具有63%的同源性[2]，天然的Fip-fve為類(lèi)似啞鈴型的同源二聚體[6-7]，在酸性和高低溫條件下均能保持良好的生物學(xué)活性[8]。Fip-fve具有血細(xì)胞凝集活性，可以在體外凝集4種類(lèi)型的人血細(xì)胞。Fip-fve還可以促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞增殖，并且明顯增加多種細(xì)胞因子分泌包括白介素2和干擾素γ[9]。Fip-fve具有良好的抗過(guò)敏活性，有研究表明其可以完全抑制由牛血清蛋白 (BSA) 引起的小鼠系統(tǒng)過(guò)敏反應(yīng)[1]，能夠抑制嗜酸性粒細(xì)胞引起的過(guò)敏性鼻炎[10]，F(xiàn)ip-fve還可以抑制卵清蛋白 (OVA) 引起的食物過(guò)敏反應(yīng)[11]和用來(lái)治療羽刺皮癬螨2型抗原 (Dp-2) 引起的呼吸道炎癥[12]。此外，F(xiàn)ip-fve還具有抗腫瘤活性[13]，Chang等發(fā)現(xiàn)給患有肝癌的小鼠口服喂食Fip-fve可以延長(zhǎng)患病小鼠的存活期[14]，干擾素γ可能是起抗腫瘤活性的關(guān)鍵效應(yīng)分子[15-16]。

從天然金針菇子實(shí)體中提純Fip-fve過(guò)程繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且產(chǎn)率較低[5]，因此越來(lái)越多的研究學(xué)者嘗試?yán)没蚬こ痰氖侄卧诓煌谋磉_(dá)宿主中重組表達(dá)Fip-fve，以期望得到高效表達(dá)的重組蛋白。1997年，Lin等首先將fip-fve基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，獲得了谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶融合的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，表達(dá)水平分別5 mg/L, 但是其生物學(xué)活性?xún)H為天然Fip-fve的一半[17]。之后，他們又將該蛋白在昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)——Sf21細(xì)胞 (草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda) 中進(jìn)行表達(dá)，重組Fip-fve具有類(lèi)似天然蛋白的生物學(xué)活性，但是產(chǎn)量依然較低，為6.25 mg/L (3.1 μg/1×106cells)[18]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近些年來(lái)興起的一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于其兼有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用，考慮金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的特點(diǎn)和其他表達(dá)系統(tǒng)的不足，本研究以畢赤酵母為宿主，進(jìn)行fip-fve基因誘導(dǎo)型和組成型兩種重組表達(dá)，探究其在兩種模式下的重組表達(dá)效率并檢測(cè)重組Fip-fve的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

大腸桿菌Excherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞和pGM-T載體購(gòu)自北京天根生化有限公司；畢赤酵母Pichia pastoris GS115和表達(dá)載體pPIC9為本實(shí)驗(yàn)室保存；金針菇Flammulina velutipes子實(shí)體購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.1.2 酶和試劑

限制性?xún)?nèi)切酶，DNA和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為大連TaKaRa產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶為北京天根生化有限公司產(chǎn)品；Sephadex G-100為美國(guó)GE產(chǎn)品；人血紅細(xì)胞由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院志愿者提供；小鼠抗Fip-fve的多克隆抗體由天津天健生物制藥有限公司制備；預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)、PV膜、羊抗小鼠HRP-抗體和ECL熒光試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒為美國(guó)ZYMO產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、YPD、BMM和MD培養(yǎng)基參考畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)[19]。畢赤酵母誘導(dǎo)型培養(yǎng)基改進(jìn)為：YNB，6.7 g/L，酵母粉，0.1 g/L，蛋白胨，0.2 g/L。組成型培養(yǎng)基改進(jìn)為：YNB，6.7 g/L，酵母粉，0.2 g/L，蛋白胨，0.4 g/L，葡萄糖/甘油，10%。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

按照程度等的方法提取金針菇及酵母的基因組DNA[20]。根據(jù)已知的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因序列和酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列分別設(shè)計(jì)fip-fve及pgap的擴(kuò)增引物 (表1)。上述引物均由上海生工生物公司合成。fip-fve的PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃1 min，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。pgap的PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂條凝膠電泳，分別回收330 bp (fip-fve) 和 500 bp (pgap) 左右的片段，與pGM-T載體 (Amp+) 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性克隆送至上海生工生物公司測(cè)序。

表1 本研究所用相關(guān)引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 載體構(gòu)建

提取含有fip-fve的pGM-T質(zhì)粒DNA，與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9 (Amp+) 同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳，回收f(shuō)ip-fve和pPIC9片段，連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)Amp抗性篩選和菌落PCR檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆，獲得誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve。提取含有PGAP的pGM-T質(zhì)粒DNA，與誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve (Amp+) 同時(shí)進(jìn)行SacⅠ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳，回收pgap和pPIC9-FIP-fve片段，連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)Amp抗性篩選和菌落PCR檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆，獲得組成型表達(dá)載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選

大量提取質(zhì)粒pPIC9-FIP-fve和pPIC9-PGAP-FIP-fve (≥5 μg)，用SacⅠ酶切，回收目的片段。酵母感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化參考酵母轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行操作，將轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于不含氨基酸的MD固體平板上，30 ℃培養(yǎng)2–3 d，直至長(zhǎng)出酵母轉(zhuǎn)化子。將不同酵母轉(zhuǎn)化子重新接種至新MD平板，編號(hào)，以fip-fve引物進(jìn)行酵母菌落PCR檢測(cè)。

1.2.4 重組Fip-fve表達(dá)與檢測(cè)

挑取PCR陽(yáng)性的酵母菌落進(jìn)行重組表達(dá)，轉(zhuǎn)pPIC9-FIP-fve的進(jìn)行誘導(dǎo)型重組表達(dá)，先將酵母接種YPD液體培養(yǎng) (200 mL/500 mL 三角搖瓶，共10瓶)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16–18 h，離心收集菌體，再轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基BMM (200 mL/500 mL 三角搖瓶，共2瓶) 中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每隔1天補(bǔ)加1%甲醇，同時(shí)取培養(yǎng)液離心收集上清。轉(zhuǎn)pPIC9-PGAP-FIP-fve的酵母進(jìn)行組成型表達(dá)，將PCR陽(yáng)性的酵母菌分別接入含有葡萄糖和甘油的組成型液體培養(yǎng)基(200 mL/500 mL 三角搖瓶，各1瓶)，30 ℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)6 d，每隔1天取培養(yǎng)液離心收集上清。取10 μL上述培養(yǎng)液及野生型GS115培養(yǎng)液 (負(fù)對(duì)照) 上清與等體積二倍點(diǎn)樣緩沖液混勻，沸水煮3 min，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)取5 μL，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，其中濃縮膠為5%，分離膠為12%。取不同培養(yǎng)天數(shù)的10 μL誘導(dǎo)型重組表達(dá)的培養(yǎng)液上清進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，其中一抗按1∶20 000稀釋?zhuān)拱?∶2 500稀釋?zhuān)珽CL發(fā)光試劑盒中A、B液各取1 mL混勻，均有涂布于所轉(zhuǎn)PV膜上，于暗室中進(jìn)行X-光片曝光5–20 s。

1.2.5 重組Fip-fve血細(xì)胞凝集活性檢測(cè)

取酵母發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min收集上清，加硫酸銨至95%飽和，12 000 r/min離心20 min，取蛋白質(zhì)沉淀，重溶于PBS (pH 7.2，10 mmol/L)，透析，超濾，上樣于Sephadex G-100 (1.5 cm×60 cm)進(jìn)行柱層析，得到初步純化的重組Fip-fve。取健康人血細(xì)胞2 mL，2 000 r/min室溫離心5 min。收集血紅細(xì)胞，用10 mmol/L PBS (pH 7.2) 反復(fù)洗滌并離心3次，最終調(diào)整血細(xì)胞懸浮液為1.5% (V/V)。血細(xì)胞凝集反應(yīng)液由25 μL血細(xì)胞懸浮液，25 μL重組Fip-fve (終濃度2 μg/mL) 蛋白液和50 μL明膠 (0.2%) 混合，加至96孔血凝板，同時(shí)以植物凝集素 (PHA，2 μg/mL) 和天然純化的Fip-fve分別作為正對(duì)照，以PBS作負(fù)對(duì)照，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于1.5 h和24 h后肉眼和顯微鏡下觀察血細(xì)胞凝集結(jié)果[21]。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

從金針菇子實(shí)體基因組DNA中擴(kuò)增fip-fve基因，連接至pGM-T載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后(結(jié)果未顯示)，再連接至pPIC9上構(gòu)建出誘導(dǎo)型畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve，示意圖見(jiàn)圖1，并進(jìn)行EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切電泳檢測(cè) (圖2)。然后以pgap啟動(dòng)子替換原載體上的paox1構(gòu)建組成型畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。

2.2 重組酵母轉(zhuǎn)化子的獲得與鑒定

將SacⅠ酶切后的線性表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve和pPIC9-PGAP-FIP-fve轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，在不含氨基酸的MD培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得的重組酵母轉(zhuǎn)化子以fip-fve引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè) (圖3)。

2.3 重組Fip-fve的表達(dá)與檢測(cè)

按著畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)方法[14]，分別進(jìn)行fip-fve的誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)，培養(yǎng)基上清用于SDS-PAGE檢測(cè) (圖4、5)，與負(fù)對(duì)照相比，在14 kDa和17 kDa處明顯有蛋白質(zhì)條帶。重組Fip-fve的表達(dá)量用凝膠掃描和分析系統(tǒng)(JYO4S-3C) 進(jìn)行光密度吸收分析和目的重組

圖1 誘導(dǎo)型畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve的示意圖Fig. 1 Plasmid map of the inducible recombinant vector pPIC9-FIP-fve.

圖2 誘導(dǎo)型畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9-FIP-fve的酶切鑒定Fig. 2 Identification of the inducible recombinant vector pPIC9-FIP-fve by enzyme digestion. 1: recombinant vector pPIC9-FIP-fve; 2: the DNA marker DL15 000 (bp); 3: pPIC9-FIP-fve digested with EcoRⅠ; 4: pPIC9-FIP-fve digested with BamHⅠ; 5: pPIC9-FIP-fve digested with KpnⅠ; 6: DNA marker DL2 000 (bp).

圖3 菌落PCR電泳檢測(cè)重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Colony PCR and agarose electrophoresis of the recombinant P. pastoris transformants. 1: the DNA marker DL500 (bp); 2–9: different recombinant P. pastoris transformants.

Fip-fve含量的換算[22]，在以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型表達(dá)中第4天表達(dá)量最高，為158.2 mg/L，在以葡萄糖和甘油為碳源進(jìn)行組成型表達(dá)分別在第4天和第5天達(dá)到最高，分別為46.3 mg/L和29.5 mg/L (結(jié)果未顯示)。同時(shí)，以誘導(dǎo)型的重組Fip-fve進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

圖4 以葡萄糖為碳源的組成型重組Fip-fve的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the constitutive rFip-fve using glucose. 1: the protein marker (kDa); 2: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 3–8: the samples of the constitutive culture at different day (1–6 d).

圖5 以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型重組Fip-fve的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the inducible rFip-fve using methanol. M: the protein marker (kDa); 1: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 2–6: the samples of the inducible culture at different day (1–5 d); 7: the native Fip-fve as the positive control.

圖6 以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型重組Fip-fve的Western blotting檢測(cè)Fig. 6 Western blotting analysis of the inducible rFip-fve using methanol. M: the protein marker (kDa); 1: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 2–6: the samples of the inducible culture at different day (1–5 d); 7: the native Fip-fve as the positive control.

2.4 重組Fip-fve血細(xì)胞凝集活性的檢測(cè)

重組Fip-fve經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和Sephadex-G-100凝膠柱層析純化后，最后獲得29 mg純化重組Fip-fve，并進(jìn)行人血細(xì)胞凝集試驗(yàn)初步檢測(cè)其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，重組Fip-fve在2 μg/mL就可以明顯凝集人血細(xì)胞 (表2)，說(shuō)明重組Fip-fve具有良好的血細(xì)胞凝集活性。

表2 重組Fip-fve血細(xì)胞凝集活性檢測(cè)Table 2 Hemagglutination test of rFip-fve

3 討論

從天然的金針菇子實(shí)體或者菌絲體中提取Fip-fve產(chǎn)量比較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)也增大了成本。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是基因工程手段進(jìn)行重組Fip-fve的生產(chǎn)將有效克服上述不足。Ko等曾在大腸桿菌中成功表達(dá)fip-fve，但是產(chǎn)量較低，只有5 mg/L，并且重組的Fip-fve僅具有天然蛋白生物學(xué)活性的一半[17]。Wu等又將fip-fve在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有良好生物學(xué)活性的重組蛋白，但是產(chǎn)量依舊較低，僅有6.25 mg/L[18]。Zhang等將該基因引入組氨酸標(biāo)簽在大腸桿菌中也進(jìn)行了融合表達(dá)與純化，表達(dá)效率為22%[23]。而畢赤酵母具有原核細(xì)胞和核真核細(xì)胞的特點(diǎn)，成為功能蛋白質(zhì)和藥用蛋白質(zhì)重組表達(dá)的理想宿主。

畢赤酵母表達(dá)有兩種形式，一個(gè)是應(yīng)用乙醇氧化酶啟動(dòng)子 (paox1) 的誘導(dǎo)型表達(dá)，該表達(dá)模式以甲醇為唯一碳源進(jìn)行外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)，其最大特點(diǎn)是表達(dá)量高，但是該模式需要更換碳源，同時(shí)在表達(dá)過(guò)程中需要使用甲醇具有一定的危害性和毒性。另外一種是應(yīng)用三磷酸甘油醛脫氫酶 (pgap) 的組成型表達(dá)，該表達(dá)模式不需要更換碳源，可以是甘油、葡萄糖、油酸等，表達(dá)方式較簡(jiǎn)單、安全[19]。但是不同的目的蛋白用哪種表達(dá)方式效率更高還需要實(shí)際進(jìn)行驗(yàn)證。呂等在畢赤酵母中同時(shí)進(jìn)行了SAM合成酶 (SAMS)的重組表達(dá)，結(jié)果組成型SAMS表達(dá)量比誘導(dǎo)型高16.3%[24]。本文分別構(gòu)建了誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)載體，進(jìn)行了fip-fve在畢赤酵母GS115中兩種模式的表達(dá)，結(jié)果表明兩種模式下均能有效重組表達(dá)，而誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)量 (158.2 mg/L) 是組成型表達(dá)產(chǎn)量 (46.3 mg/L) 的3.4倍。其原因可能是paox1的超強(qiáng)啟動(dòng)子功能，有報(bào)道稱(chēng)該啟動(dòng)子是目前已知的最強(qiáng)啟動(dòng)子[25]，另外，誘導(dǎo)型表達(dá)過(guò)程中更換培養(yǎng)基，進(jìn)行了酵母菌的富集。此外，在兩種模式下表達(dá)的重組Fip-fve均有多條目的蛋白帶的產(chǎn)生，可能是由于畢赤酵母進(jìn)行了蛋白質(zhì)翻譯后的加工和修飾，尤其是糖基化修飾的緣故[26]。

經(jīng)過(guò)初步純化的重組Fip-fve表現(xiàn)出良好血細(xì)胞凝集活性，在2 μg/mL時(shí)就能明顯凝集人血紅細(xì)胞；這與天然Fip-fve一致，說(shuō)明從畢赤酵母GS115獲得的重組Fip-fve具有良好的血細(xì)胞凝集活性和初步的生物學(xué)活性，可以進(jìn)行下一步的研究和開(kāi)發(fā)。另外，我們還需要調(diào)整和優(yōu)化表達(dá)體系和條件，以期獲得更高產(chǎn)量的重組目的蛋白。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Inducible and constitutive expression of fip-fve from Flammulina velutipes in Pichia pastoris GS115

Jingwei Lin1,2, Jia Jia2, Ming Zhong2, Lijing Chen2, Haoge Li2, Zhifu Guo2, Mingfang Qi1, Lixia Liu3, and Tianlai Li1

1 College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China
2 College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China
3 School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, Jilin, China

We transformed the fip-fve gene into Pichia pastoris GS115 for inducible and constitutive expression to obtain feasible bioactvie recombinant Fip-fve. The fip-fve gene was cloned from Flammulina velutipes fruting body by PCR and ligated to pPIC9 to construct inducible expression vector pPIC9-FIP-fve, and promotor pgap was used to replace the paox1 to construct constitutive expression vector pPIC9-PGAP-FIP-fve. These two vectors were used to transform P. pastoris by PEG method. The fip-fve was expressed after histamine-absence screening and yeast colony PCR. The inducible expression level reached 158.2 mg/L at the fourth day and the constitutive expression level was 46.3 mg/L and 29.5 mg/L using glucose and glycerol, respectively. The SDS-PAGE and Western blotting both proved the correctness of rFip-fve, and the hemagglutination test indicats the rFip-fve’s bioactivity.

Flammulina velutipes, immunomodulation, Pichia pastoris, constitutive expression

May 19, 2013; Accepted: August 20, 2013

Tianlai Li. Tel: +86-24-88487004; E-mail: tianlaili@126.com

林景衛(wèi), 賈佳, 鐘鳴, 等. 金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-fve在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)型和組成型表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 464?471.

Lin JW, Jia J, Zhong M, et al. Inducible and constitutive expression of fip-fve from Flammulina velutipes in Pichia pastoris GS115. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 464?471.

Supported by: National Natural Science Foudation of China (No. 31000928).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31000928) 資助。

時(shí)間：2013-9-13 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130913.0912.002.html