雷公藤多苷對脂多糖致急性肺損傷大鼠保護(hù)機(jī)制研究

鄒 蕾，黃志遠(yuǎn)，崔 巖，高 燕

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，遼寧沈陽 110016

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由于多種因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成肺間質(zhì)及肺泡彌漫性水腫，進(jìn)而導(dǎo)致急性呼吸功能不全［1］。ALI是導(dǎo)致急重癥患者死亡的常見原因之一，ALI患者死亡率極高，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的干預(yù)措施［2］。因此，尋找有效的治療藥物是治療急性肺損傷亟待解決的難題之一。近年來研究核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路是炎癥反應(yīng)發(fā)生的中樞環(huán)節(jié)之一，它在ALI-急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［3，4］。雷公藤多苷(tripterygium glycosides，GTW)具有明顯的抗炎、免疫抑制、抗生育及抗腫瘤活性作用，含雷公藤多甘的中藥制劑常用于治療關(guān)節(jié)炎、自身免疫性紊亂、器官移植、糖尿病腎病、哮喘及腫瘤等多種疾病抗氧化、抗炎、抗黏附作用［5，6］。然而，雷公藤多苷對急性肺損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制ALI模型，旨在研究雷公藤多苷對急性肺損傷的保護(hù)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 脂多糖、鼠抗NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗IGg(美國Sigma公司)。二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(中衫金橋試劑公司)。雷公藤多苷(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司)。血?dú)夥治鰞x(美國Nova Biomedical);Olympus生物顯微鏡，Image Pro Plus數(shù)碼顯微鏡照相分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 建立急性肺損傷模型 60只雄性清潔級Wistar大鼠，體重200～220 g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，動(dòng)物隨機(jī)分為對照組(NS組)、急性肺損傷組(LPS組)和雷公藤多苷干預(yù)組(GTW組)。實(shí)驗(yàn)過程中，LPS組和GTW組分別通過股靜脈注射5 mg/kg LPS，建立急性肺損傷模型。GTW組在注射LPS前30 min，靜脈注射10 mg/kg GTW，NS組和LPS組給予等量生理鹽水。

1.2.2 測定動(dòng)脈氧分壓 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血0.5 ml，采用血?dú)夥治鰞x測定各組動(dòng)物的PaO2。

1.2.3 標(biāo)本采集 造模后9 h，采用戊巴比妥鈉2.0 mg/kg腹腔麻醉大鼠，逐層解剖大鼠胸部組織，分離肺臟，剔除結(jié)締組織，用生理鹽水清洗血液，用分析天平稱重。分離右肺上葉，用10%甲醛溶液固定，用于病理形態(tài)學(xué)觀察;將剖取的右肺下葉置于-80℃液氮罐中，用于檢測NF-κB蛋白表達(dá)。

1.2.4 肺組織濕/干重比(W/D) 稱取左上肺濕重后，將其置于65℃恒溫烤箱中，烘烤48 h，待其重量穩(wěn)定后，稱量肺臟干重，計(jì)算肺濕/干重比。

1.2.5 炎癥細(xì)胞因子檢測 采用ELISA方法，檢測肺組織勻漿液中炎癥因子表達(dá)，組織勻漿液的制備過程參照說明書。炎癥因子IL-β、IL-6、IL-10及TNF-α檢測及濃度計(jì)算參考試劑盒說明書。

1.2.6 Western blot檢測 提取大鼠肺組織總蛋白用于肺組織中NF-κB和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)表達(dá)檢測。取30 mg肺組織于500 μl瑞帕(RIPA)中勻漿，并加入5 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑混合物，0℃條件下勻漿20 min，勻漿后14 000 r/min離心15 min，取400 μl上清液備用。Western blot實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行?？筃F-κB抗體工作稀釋度為1：500，抗GAPDH為1：500;二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗為1：1 000。使用軟件計(jì)算NF-κB灰度值比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用(±s)表示，定量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈PaO2分析結(jié)果 LPS注射后大鼠呼吸、心率明顯增快，反應(yīng)淡漠，精神萎靡。與對照組相比，LPS組PaO2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而GTW組PaO2較LPS組有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 肺組織濕/干重(W/D)比值測定 LPS組大鼠肺濕干比W/D值，較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而GTW組肺濕干比W/D值明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下，對照組肺泡間隔厚度適中，肺泡壁完整，間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1A)。LPS組與對照組相比，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔有滲出物，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤明顯(圖1C)。GTW組肺組織存在淤血、出血及間隔增寬等現(xiàn)象，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤，肺損傷程度較LPS組減輕(圖1E)。

2.4 肺組織NF-κB免疫組化表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，NF-κB在對照組肺組織沒有表達(dá)(圖1B)。LPS組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖1D)，GTW組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)較LPS組降低(圖1F)。

圖1 各組病理形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)果比較

2.5 炎癥因子表達(dá)檢測 與對照組相比，LPS組促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯升高，而抑炎因子IL-10水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組相比，GTW組上述炎癥因子表達(dá)明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組炎性因子表達(dá)比較

2.6 NF-κB蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，LPS組大鼠NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與LPS組比較，GTW組大鼠NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

3 討論

急性肺損傷是指肺內(nèi)外各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，急性呼吸困難、難治性低氧血癥和雙側(cè)肺部浸潤性病變是其典型表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，LPS可以導(dǎo)致急性肺損傷大鼠動(dòng)脈血?dú)釶aO2明顯降低，肺組織濕/干重比升高，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔可見滲出物，間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤等典型的肺損傷改變，同時(shí)導(dǎo)致促炎癥因TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平較對照組明顯升高，而抑炎因子IL-10水平明顯下降。TNF-α、IL-1β、IL-6是人體重要的抗炎因子，在炎癥發(fā)生中這些因子表達(dá)明顯升高，而IL-10則是重要的抗炎因子之一，其高表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)，保持炎癥反應(yīng)在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡［7］。急性肺損傷時(shí)抗炎因子分泌量明顯減少，不能有效的對拮抗炎性因子所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，勢必會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在肺間質(zhì)內(nèi)的大量浸潤、組織水腫、器官功能損害，極大地增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道顯示，急性肺損傷死亡患者的疾病初期，可發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中的IL-10濃度較低［8-10］。結(jié)果提示，IL-10蛋白分泌降低可能是導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子表達(dá)增多及肺內(nèi)炎癥反應(yīng)加重的主要原因。

圖3 各組NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

雷公藤是最常見的中藥之一，具有活血通絡(luò)、消腫止痛等功效，在臨床上多用于治療類風(fēng)濕、腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾?。?1，12］。研究證實(shí)，雷公藤具有較好的抗腫瘤、抗炎及抗氧化等作用，而雷公藤多苷是從雷公藤的去皮根部提取的總苷，是其主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷通過抑制NF-κB蛋白，促進(jìn)前列腺癌的凋亡［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤多苷抑制糖尿病腎病大鼠炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到減輕腎病的效果［14］。雷公藤多苷可以減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，明顯改善大鼠的肺功能，機(jī)制可能與上調(diào)改善 IL-10、Foxp3和下調(diào) TNF-α表達(dá)密切相關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷可明顯改善急性肺損傷大鼠的動(dòng)脈血PaO2水平，降低肺臟濕/干重比，改善肺組織病理學(xué)改變，下調(diào)TNF-α、IL-1β及IL-6和上調(diào)IL-10蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，LPS組NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，而雷公藤多苷明顯降低肺組織NF-κB蛋白表達(dá)。使肺損傷程度減輕。NF-κB可以與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的核因子，經(jīng)典的NF-κB是p65/p50二聚體結(jié)構(gòu)，NF-κB激活后可以促進(jìn)TNF-α等炎癥因子的生成，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)［16］。研究證實(shí)，LPS通過激活NF-κB蛋白誘發(fā)大量促炎因子生成是急性肺損傷發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，NF-κB激活是炎癥反應(yīng)蛋白表達(dá)的終末控制點(diǎn)，故降低NF-κB活性可能是治療ALI的一個(gè)有效方案［17］。本研究表明，雷公藤多苷可明顯減輕LPS導(dǎo)致的肺部急性炎性反應(yīng)，其保護(hù)機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。雷公藤多苷具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值，并為其治療提供新的理論依據(jù)。

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