熒光增敏法測(cè)定咽炎片中丹皮酚的含量*

(泰山醫(yī)學(xué)院化工學(xué)院,山東 泰安 271016)

咽炎片由玄參、百部、天冬、牡丹皮等12味藥組成，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清熱解毒、清利咽喉、鎮(zhèn)咳止癢的功效，丹皮酚為主藥牡丹皮的有效成分，是一種小分子的酚類化合物，呈白色針狀結(jié)晶，其化學(xué)名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌和抗炎作用[1]。目前檢測(cè)丹皮酚的方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3-5]、氣相色譜法[6]、電化學(xué)方法[7]等。為有效地控制制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)基于AlCl3試劑對(duì)丹皮酚具有熒光增敏作用，建立了丹皮酚含量測(cè)定的熒光分析法，并成功用于咽炎片中丹皮酚含量的測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確, 適合作為該品種的測(cè)定方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301熒光分光光度計(jì)(日本島津)； UV-5300紫外分光光度計(jì)；FC204型電子天平；pHS23C型酸度計(jì)。

丹皮酚溶液：稱取0.0033 g丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110708-200505)，用少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成0.33 μg/ml的溶液，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成3.3×10-3μg/ml的溶液；AlCl3溶液：稱取6.60 g AlCl3(分析純)，置于小燒杯中，加適量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容，配成0.50 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液：分別配成0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液和0.3 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，按不同的比例配成pH 5.8～8.0的一系列緩沖溶液。

試驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

于10 ml比色管中，依次加入0.50 mol/L AlCl3溶液1.00 ml，適量的丹皮酚溶液， 1.00 ml pH 7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，用二次水定容至10 ml。室溫放置5 min，于λem= 455 nm處測(cè)定其與試劑空白的熒光強(qiáng)度(λex= 295 nm)。測(cè)定體系熒光強(qiáng)度F與試劑空白的熒光強(qiáng)度F0，計(jì)算ΔF=F0- F。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

考察了丹皮酚及其與Al( Ⅲ)相互作用的紫外吸收光譜，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚的最大吸收峰為275 nm，加入鋁離子其最大吸收峰紅移至295 nm，但其吸收強(qiáng)度變化不大，如圖1所示。這種現(xiàn)象表明丹皮酚與Al( Ⅲ )發(fā)生了反應(yīng)，生成了新的配合物。

2.2 熒光光譜

考察了丹皮酚及其與Al( Ⅲ)相互作用的激發(fā)光譜和熒光光譜，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚自身的熒光強(qiáng)度很弱，但加入Al( Ⅲ )后其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，如圖2所示。實(shí)驗(yàn)表明，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm，且在455 nm處熒光強(qiáng)度F值在一定范圍內(nèi)與加入的丹皮酚濃度成比例，隨著丹皮酚濃度增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖1 丹皮酚及丹皮酚-鋁( Ⅲ)配合物的紫外吸收光譜

圖2 丹皮酚及丹皮酚-鋁( Ⅲ )配合物的熒光發(fā)射光譜曲線

1: 3.3 ×10-4μg/ml paeonol; 2: 1.32×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 3: 1.98×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 4: 2.64×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 5: 3.30×10-3μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 6: 3.96×10-3μg/ml paeonol + 0.05mol/L AlCl3

2.3 AlCl3用量的選擇

在實(shí)驗(yàn)條件下，固定丹皮酚的濃度，考察了AlCl3用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AlCl3溶液用量在0.60～1.50 ml范圍內(nèi)體系熒光強(qiáng)度增大值ΔF有較大值且穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇0.50 mol/L AlCl3溶液用量為1.00 ml。

2.4 酸度的影響及其用量

溶液酸度影響配合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其光譜性質(zhì)。向體系中加入不同pH的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，按實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定含Al(Ⅲ)體系與空白體系的熒光強(qiáng)度值F和 F0，得到熒光強(qiáng)度差值ΔF。結(jié)果表明，在pH 6.6～7.4之間熒光強(qiáng)度增大值ΔF有較大值且穩(wěn)定。因此選擇pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液來(lái)控制體系的酸度。本實(shí)驗(yàn)選用1.00 ml緩沖液為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

2.5 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響

本體系的反應(yīng)在室溫下能迅速完成，且升高溫度對(duì)熒光強(qiáng)度猝滅值無(wú)太大影響，室溫下熒光強(qiáng)度在10 h內(nèi)基本恒定。

2.6 工作曲線與檢出限

在最佳試驗(yàn)條件下，測(cè)定了丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度。以熒光增大值ΔF對(duì)其質(zhì)量濃度繪制工作曲線。得到丹皮酚的線性回歸方程為ΔF =89.45ρ(×10-3μg/ml)- 0.2777，線性范圍為1.3 ×10-4～ 7.3 ×10-4μg/ml，相關(guān)系數(shù)r=0.999，檢出限(3s/k)為0.8 ×10-4μg/ml。

2.7 共存離子的影響

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，丹皮酚濃度為3.3×10-4μg/ml，相對(duì)誤差不大于±5.0%時(shí)，可允許的共存物質(zhì)量(以mol/L計(jì))為：K+(1.0)，Ca2+(0.8)，Mg2+(1.2)，Zn2+(0.5)，Ni2+(0.1)，Cu2+(0.05)，Mn2+(0.4)；Cd2+(0.2)；Hg2+(0.02)，Cr3+(0.06)，F(xiàn)e3+(0.002)。

3 樣品的測(cè)定

取10片咽炎片，除去包衣，精密稱重2.391 g，取2.00 g放入蒸餾燒瓶中，浸泡3 h加0.12 g NaCl，控制溫度在100℃蒸餾，收取50 ml餾分，再加少許水進(jìn)行二次蒸餾，合并餾分，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，定容。經(jīng)適當(dāng)稀釋后用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)加入回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果(n=6)

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