直接顯微鏡菌落觀察法診斷念珠菌*

張婷婷 劉 晶 張 莉

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000)

作為真菌中最常見的條件致病菌，念珠菌又名假絲酵母菌，它廣泛的存在于自然界，尤其是水、蔬菜、水果、奶制品中[1]。正常情況下念珠菌可存在于健康人的口腔、腸道、陰道等處，無致病性,但當人體抵抗力下降時，其作為條件致病菌,感染呈上升趨勢[2]。其中以白色念珠菌最為常見，致病力也最強。(近年來，由于糖尿病，肺結核，腫瘤，嚴重燒傷，臟器移植等基礎疾病的發(fā)生，而導致的患者機體免疫力下降以及由此引發(fā)的念珠菌感染呈現(xiàn)高發(fā)的趨勢。因此，準確，快速的念珠菌鑒定，及時的向臨床醫(yī)師提供可靠的確診報告就成為檢驗科微生物室亟待解決的課題。)因不同的真菌菌落所表現(xiàn)特征差別顯著，如念珠菌在普通瓊脂、血瓊脂與沙保弱培養(yǎng)基上，具有生長良好，菌落為灰白色或奶油色，表面光滑等特點，可為真菌分類工作提供重要的診斷依據(jù)。筆者自2009 年8月至2013年6月對我院微生物室收集的105例念珠菌陽性標本,分別采用直接顯微鏡菌落觀察法、顯微鏡不染色直接鏡檢及革蘭氏染色法進行了鑒定實驗，試圖對比分析出何種鑒定方法更加準確快速及時，以更好的服務于臨床診斷治療。

1 材料與方法

1.1標本來源：我院自2009年8月至2013年6月臨床科室送檢細菌培養(yǎng)念珠菌陽性標本105例，其中痰62例、尿32例，血培養(yǎng)2例，其它標本9例。

1.2方法：①直接顯微鏡菌落觀察法：將培養(yǎng)后的念珠菌的沙保弱(或中國藍)折光性較好的平板，直接放置于顯微鏡(奧林帕斯)上，調(diào)動細螺旋，用低倍鏡仔細觀察菌落。②顯微鏡不染色直接鏡檢法：用取菌環(huán)取菌落置于滴有無菌生理鹽水的涂片上，在顯微鏡下觀察。③革蘭染色法：常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢(注明染色液試劑品牌，公司)。

2 結 果

2.1三種方法的鏡下觀察情況 ①直接顯微鏡菌落觀察：可以看到背景下多個的圓形的菌落，普通的細菌菌落區(qū)別于黃色的普通細菌菌落而念珠菌的菌落為黑色、均勻的細砂粒狀(見圖1、圖2)，在營養(yǎng)豐富的生長條件下還能很明顯看到芽生孢子，這是區(qū)別于其它細菌的顯著特點。鏡下觀察普通細菌菌落無論如何調(diào)整焦距及變換視野，菌落鏡下菌落形態(tài)不會有任何明顯變化，而只能觀察到菌落呈現(xiàn)均一的黃色，沒有細沙粒狀的形態(tài)。②顯微鏡不染色直接鏡檢法：陽性標本可見有菌絲、孢子或單細胞真菌[3]。③革蘭染色法：念珠菌為革蘭染色陽性，菌體圓形或卵圓形。

2.2三種方法的操作步驟和耗時情況 見表1。

表1 三種方法的操作步驟和耗時情況

*方法1和方法2比較，**方法1和方法3比較，***方法2和方法3比較。

這三種方法所消耗的時間為同一個熟練的技術操作人員在相同的實驗條件下分別對105個樣本進行觀察和操作所分別消耗的時間的平均值。P<0.05,時間差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 ：念珠菌的菌落為黑色、均勻的細砂粒狀(×10)；

圖2 ：念珠菌的菌落為黑色、均勻的細砂粒狀，圖中可以清楚的看到芽生孢子(×10)；

圖3 普通的細菌菌落，菌落呈現(xiàn)均一的黃色

圖4 普通的細菌菌落，菌落呈現(xiàn)均一的黃色(×10)。

3 討 論

真菌為真核細胞性微生物，在自然界分布廣泛，種類繁多，數(shù)量極大，其中絕大多數(shù)對人類有益，但少數(shù)也可引起感染性、中毒性以及反應性疾病。尤其近年來，伴隨著腫瘤，慢性消耗性疾病和器官移植后免疫抑制劑的使用而發(fā)生的真菌并發(fā)感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢，成為醫(yī)院難治性感染疾病的重要組成部分，因此，尋找一種準確快速高效的念珠菌鑒定方法就成為檢驗科微生物室當前的重要工作目標。但是念珠菌菌落在不同成分的培養(yǎng)基上所呈現(xiàn)的形態(tài)結構并不完全相同，因此我們對目前常用的三種念珠菌鏡下檢驗方法進行了對比實驗，以確定何種方法更加準確快速，以期更好的服務于臨床工作。通過本研究的三種念珠菌鑒定方法對比實驗數(shù)據(jù)證實，不染色鏡檢法是較為直接快速的檢驗方法，特別是對于細胞和酵母菌，能通過顯微鏡最直觀的做出鑒別，但是消耗的時間多于直接菌落觀察法(P<0.05)。

革蘭染色法作為最為經(jīng)典的染色法，仍是我們常規(guī)工作中的首選。經(jīng)革蘭染色后孢子在顯微鏡下很易識別，標本陽性率較高,但是相對于其它兩種方法，耗時較長，步驟繁多。

直接顯微鏡菌落觀察法較為簡單，不需要涂片、染色，操作更為容易。而且對于培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿上，在念珠菌和細菌較難鑒別時，此法更能直接作出判斷。在三種方法中耗時最短，步驟簡單，準確高效。因此，從2009年8月至今，我院微生物室工作人員通過運用直接顯微鏡菌落觀察法后，不僅提高了工作效率、節(jié)省了時間，而且還節(jié)約了成本，通過與染色法對照實驗證實，對念珠菌檢驗無一例漏檢。優(yōu)于其它方法，值得推廣應用，由此證明念珠菌的直接菌落鏡檢法具有準確快速高效的特點，在今后的臨床檢驗工作中可以發(fā)揮其優(yōu)勢，更經(jīng)濟更有效的豐富日常檢驗技術方法。

[1] 葉應嫵，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第3版．南京：東南大學出版社．2006：235-237.

[2] 沈雪敏，薛婷君，施琳俊,等. 小檗堿對白色念珠菌細胞周期的影響[J].中國口腔醫(yī)學雜志,2012,47(1):123-126.

[3] 陳佩宣.念珠菌快速測定試劑盒的選擇[J].2011,8(2):226-227.