Biolog ECO和DGGE 數(shù)據(jù)幾種分析方法的比較研究

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(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性研究中心,云南 昆明 650201；2.宣威市農(nóng)業(yè)局農(nóng)技推廣中心,云南 宣威 655400)

過去的研究中，微生物多樣性的數(shù)據(jù)采集方法主要包括：Biolog ECO[1]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[2-3]、磷脂脂肪酸(PLFA)[4]、宏基因組(Metagenome)[5]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)[6]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)[7]等技術(shù)。其中，Biolog ECO和DGGE是微生物研究的重要工具。微生物多樣性的數(shù)據(jù)是多元變量，目前，多元變量分析方法有無監(jiān)督分析方法及有監(jiān)督的分析方法2種。無監(jiān)督分析方法中的主成分(PCA)常用于不同環(huán)境條件下微生物多樣性差異的研究，但是無監(jiān)督分析方法存在以下問題：無法建立模型及進(jìn)行可靠性檢測；無法進(jìn)行分類，無法識(shí)別樣本間微小差異，目標(biāo)性弱，結(jié)果分散，效率低；臨界值的判定依賴PCs的得分系數(shù)，目前無統(tǒng)一的臨界值。有監(jiān)督的分析方法有最小二乘法(PLS)[8]、正交最小二乘法(OPLS)[9-10]、kernel 函數(shù)正交最小二乘法(K-OPLS)[11]、最小二乘法判別法(PLS-DA)[12]、最小二乘法增強(qiáng)判別法(PLS-EDA)、正交最小二乘法判別法(OPLS-DA)[13]、kernel函數(shù)正交最小二乘法判別法(K-OPLS-DA)[14]等。有監(jiān)督的分析方法克服無監(jiān)督分析方法的弱點(diǎn)，可對微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行分組、分類，結(jié)果直觀，目標(biāo)性強(qiáng)，采用VIP(Variable important)≥1.00作為臨界值。目前，有監(jiān)督的分析方法僅有最小二乘法(PLS)[8]用于微生物多樣性的研究。

為更好地解釋不同環(huán)境對土壤微生物的碳源代謝及物種多樣性影響，研究通過比較PCA、PLS-DA、PLS-EDA及PLS、OPLS分析法，來實(shí)現(xiàn)微生物在不同環(huán)境中差異及差異代謝碳源的鑒定及物種的鑒定。

1 材料與方法

1.1 土壤取樣

于2011年，分別在昭通靖安及魯?shù)椤⒗ッ鲗さ槿∮衩着c馬鈴薯間作(種植模式2∶2)收獲時(shí)期的土壤樣品，每個(gè)點(diǎn)取3～5份。用于Biolog ECO分析的土壤樣品以最快速度置于4℃冰箱保存，用于DGGE分析的土壤樣品用1.5 ml離心管裝好置于-80℃冰箱保存。

1.2 基質(zhì)利用的評(píng)價(jià)

采用Biolog ECO(Biolog .Inc.CA)平板作為基質(zhì)，平板培養(yǎng)及數(shù)據(jù)讀取參照文獻(xiàn)進(jìn)行[1]，獲得的數(shù)據(jù)選擇120 h進(jìn)行多元變量分析。

1.3 土壤DNA的提取及PCR-DGGE

土壤DNA采用百泰克(E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)按照說明書提取。

1.3.1PCR。選取細(xì)菌16SrRNA V6-V9高變區(qū)引物：F-968-GC (5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGCGGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’)和R-1401(5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’)，PCR產(chǎn)物的片段為500 bp，PCR方法采用TD-PCR，94℃ 8 min，94℃ 1 min，60℃-50℃ 1 min，72℃ 1 min 10個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min 25個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存，反應(yīng)結(jié)束后置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。反?yīng)體系：2×Master Mix 25 μL，dd H2O 21.50 μL，BSA 0.5 μL，F(xiàn)-968-GC 1 μL，R-1401 1 μL，模板1 μL，采用1.2%瓊脂糖電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物。

1.3.2DGGE。100 μL PCR產(chǎn)物用Bio-Rad旋蒸儀濃縮5～6倍，The Dcode Universal Mutation Detection Delivery System(Bio-Rad )用于灌制30% ～ 65%梯度膠。具體過程為：各取15 mL30%和65%的變性膠，加340 μL的溴酚藍(lán)染液到65%高濃度膠中，混勻。然后，分別在30%和65%的變性膠加入170 μL過硫酸銨(10%)和17 μL TEMED，快速灌膠，聚合1 h ～ 2 h。將1×TAE在Bio-Rad Dcode Mutant detect system電泳槽中預(yù)熱到60℃，濃縮樣品與等體積的Loading buffer混合后，取20 μL上樣到聚丙烯酰胺變性凝膠6% 梯度為30%～65%膠孔中，150 V，電泳8 h，1/10000 EB染色10 min，1×TAE脫色15 min，紫外光成像系統(tǒng)Gensnap拍照獲取圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Simca-p 11.5(umertric)用于PLS 及OPLS及潛在標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)；采用MultiBase進(jìn)行PCA、PLS-DA、PLS-EDA分析。選取Biolog ECO培養(yǎng)120，在590 nm條件下，31種碳源吸光度經(jīng)消除空白后作為分析的原始數(shù)據(jù)；采用Quantity one 4.6.2軟件對DGGE圖譜數(shù)據(jù)化，統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)、亮度、位置。采用Microsoft office Excel 2010對條帶按位置進(jìn)行對齊處理,采用亮度作為分析的原始數(shù)據(jù)。DGGE和 Biolog ECO數(shù)據(jù)分析過程如下，首先在Microsoft office Excel 2010加載MultiBase 2014的宏,選中要分析的數(shù)據(jù)設(shè)置變量及處理，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，最后進(jìn)行計(jì)算導(dǎo)出圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE和 Biolog ECO數(shù)據(jù)的PCA、PLS-DA、PLS-EDA分析

圖1為DGGE結(jié)果圖，左邊5條泳道表示昭通魯?shù)?個(gè)取樣點(diǎn)；右邊5條泳道表示昭通靖安5個(gè)取樣點(diǎn)。DGGE數(shù)據(jù)分析(圖2-圖4)表明：PCA的PC1為27.1%，有2個(gè)樣品無法區(qū)分；PLS-DA的PC1為33%，有1個(gè)樣品無法區(qū)分；PLS-EDA把昭通的2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)樣品完全分開，PC1為16.8%。Biolog ECO數(shù)據(jù)分析(圖5-圖7)表明：PCA的PC1為35.1%，有6個(gè)樣品無法區(qū)分；PLS-DA的PC1為36.3%，有4個(gè)樣品無法區(qū)分；PLS-EDA把昭通的2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)和尋甸樣品完全分開，PC1為25.5%。

圖1 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 圖Fig.1 DGGE profile注：L，J表示昭通魯?shù)楹途赴苍囼?yàn)點(diǎn)。

圖2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)Fig.2 PCA analysis of DGGE data 注：a,b表示昭通兩個(gè)不同的試驗(yàn)點(diǎn)，圖3、圖4同。

圖3 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 數(shù)據(jù)的最小二乘法判別法分析(PLS-DA)Fig.3 PLS-DA analysis of DGGE data

圖4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 數(shù)據(jù)的最小二乘法增強(qiáng)判別法分析(PLS-EDA)Fig.4 PLS-EDA analysis of DGGE data

2.2 基于PLS和OPLS篩選環(huán)境微生物標(biāo)記

采用PLS和OPLS篩選VIP≥1.00的條帶和碳源作為潛在生物標(biāo)記，見表1，篩選發(fā)現(xiàn)DGGE PLS 和OPLS篩選差異較大，PLS篩選出19個(gè)帶型作為標(biāo)記，OPLS篩選出11個(gè)帶型作為標(biāo)記；Biolog差異較小，OPLS與PLS相比多2種碳源，應(yīng)綜合考慮PLS和OPLS的篩選結(jié)果。DGGE考慮到后續(xù)克隆條帶進(jìn)行微生物種類鑒定，因此，可選PLS的VIP≥1.00的條帶作為潛在生物標(biāo)記。

表1 DGGE 和Biolog微生物候選標(biāo)記Tab.1 Candidate for microbial makers in DGGE and Biolog

注：1-4、24-26、15、17-18、34-35、48、50-56、59、84、86 表示DGGE圖譜分析結(jié)果;C2、D1、A8、D7、D5、D2、D4、D8、C4、C6、B6、C8、B4、A4表示Biolog ECO碳源種類。

圖5 Biolog ECO數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)Fig.5 PCA analysis of Biolog ECO data注：a、b、c分別表示尋甸及昭通3個(gè)不同的試驗(yàn)點(diǎn)，圖6、圖7同。

圖6 Biolog ECO 數(shù)據(jù)的最小二乘法判別法分析(PLS-DA)Fig.6 PLS-DA analysis of Biolog ECO data

圖7 Biolog ECO數(shù)據(jù)的最小二乘法增強(qiáng)判別法分析(PLS-EDA)Fig.7 PLS-EDA analysis of Biolog ECO data

3 討 論

土壤微生物Biolog ECO和DGGE數(shù)據(jù)分析多采用PCA[15-16]，該方法區(qū)分不同環(huán)境樣品依賴PCs得分系數(shù)，但是樣品離散程度大，無法直觀看出環(huán)境對土壤微生物多樣性的影響，也有研究使用DCCA(Detrended canonical correspondence analysis)及CCA(Canonical correspondence analysis)方法反應(yīng)環(huán)境對土壤微生物多樣性的影響[17-19]，但是目前CANCOCO是收費(fèi)軟件，操作復(fù)雜，況且DCCA及CCA方法還有無法克服的問題。也有較少的研究者采用PLS[8]，PLS是一種有監(jiān)督的分析方法，對環(huán)境數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立可解釋變量的模型，但是需對模型的可靠性進(jìn)行判定，才能確定是否合乎邏輯與事實(shí)。因此，PCA及PLS不能有效的解釋環(huán)境變異與微生物多樣性的關(guān)系[20-21]。

PLS-DA、PLS-EDA在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中有強(qiáng)大的優(yōu)勢，尤其是分析環(huán)境條件與代謝物的關(guān)系[13,22-23]。土壤微生物多樣性的數(shù)據(jù)和代謝組數(shù)據(jù)具有相似性，都屬于多元變量。因此，研究認(rèn)為，該方法同樣適用于微生物多樣性與環(huán)境關(guān)系的研究。研究中采用PCA、PLS-DA、PLS-EDA 3種方法對Biolog ECO和DGGE數(shù)據(jù)分析作對比，發(fā)現(xiàn)PLS-EDA能夠?qū)⒉煌h(huán)境的樣品區(qū)分開來，PLS-DA能夠區(qū)分出大多數(shù)樣品，PCA無法區(qū)分不同環(huán)境的樣品。因此，PLS-DA、PLS-EDA可作為分析微生物多樣性數(shù)據(jù)的新方法。

已有的研究認(rèn)為PCA 可從Biolog ECO和DGGE數(shù)據(jù)中能夠確定哪些碳源或哪些條帶對微生物群落結(jié)構(gòu)變化起到主導(dǎo)作用，但是PCA結(jié)果過于籠統(tǒng)和模糊，依賴于碳源和帶型在PCs上的荷載大小，但目前無統(tǒng)一荷載大小臨界點(diǎn)值作為特征碳源或帶型，一些研究中采取荷載篩選與多元方差分析結(jié)合，對特征碳源或帶型進(jìn)行顯著性檢測[15-16]，此方法比較繁瑣，因此，很難篩選出有價(jià)值的碳源和物種。研究采用PLS 和 OPLS兩種方法篩選微生物標(biāo)記，參照代謝組學(xué)特異物篩選方法，規(guī)定VIP≥1.00的碳源和物種作為環(huán)境潛在代謝和物種標(biāo)記[24]。篩選結(jié)果表明：OPLS及PLS都可選出一批在不同環(huán)境中的土壤微生物潛在代謝和物種標(biāo)記，能為進(jìn)一步分析微生物的生態(tài)功能提供有價(jià)值的信息。此方法為研究不同環(huán)境下土壤微生物多樣性的特征標(biāo)記物進(jìn)行規(guī)范化鑒定。

近年來，多元變量分析廣泛使用于生物統(tǒng)計(jì)中，大量分析軟件的出現(xiàn)，不僅提高了數(shù)據(jù)分析效率，而且結(jié)果更直觀易懂[24]。在復(fù)雜樣本及復(fù)雜環(huán)境數(shù)據(jù)分析中，多元變量分析為挖掘重要信息提供無以倫比的優(yōu)勢。PLS-EDA、OPLS、PLS作為近年來發(fā)展出的新方法，同樣可作為土壤微生物多樣性數(shù)據(jù)分析最有效、最重要的方法。

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