煙草連作對土壤微生物多樣性及酶活性的影響

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(1.河南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院,河南 鄭州 450002；2.河南省許昌市煙草公司,河南 許昌 461000；3.河南省襄城縣煙草公司,河南 襄城 452670)

我國耕地面積少，作物連作現(xiàn)象十分普遍。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物,也是一種忌連作作物，但由于經(jīng)濟利益驅(qū)動烤煙連作在煙葉生產(chǎn)中十分普遍。煙草連作常導致煙株生長發(fā)育不良，品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低，土傳病害加重[1-2]。

土壤微生物作為土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力，直接關(guān)系到土壤養(yǎng)分的有效性，對作物的正常生長發(fā)育起重要作用[3-4]。土壤微生物中以細菌的種類和數(shù)量最多[5]，土壤細菌的多樣性能夠反映特定土壤環(huán)境的歷史情況[6]。土壤酶來自微生物、植物和動物的活體或殘體，通過催化土壤中的生化反應發(fā)揮重要作用，保持了土壤生物化學的相對穩(wěn)定狀態(tài)，其活性與土壤的理化性質(zhì)和其他生物學特征緊密相關(guān)，是近年來土壤質(zhì)量評估指標中必不可少的內(nèi)容[7-9]。土壤蔗糖酶、淀粉酶 、纖維素酶廣泛存在于土壤中，它們直接參與土壤有機質(zhì)的代謝過程，與土壤肥力密切相關(guān),是評價土壤肥力的重要指標之一，并能部分反映土壤生產(chǎn)力[10-13]。

研究試圖利用常規(guī)方法結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)，系統(tǒng)分析了烤煙連作對土壤細菌、真菌、放線菌數(shù)量和3種土壤酶活性的影響規(guī)律，以期為煙田土壤的可持續(xù)利用和克服連作障礙提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗土壤樣品于2011年9月采自許昌市襄城縣庾河村(GPS信息：33.99°N，113.56°E，H：113 m)連作1a-8a的21塊煙田，其中煙草連作1a-6a土樣各3個、連作8a土樣3個，但沒有采集到連作7a的土樣。采樣時遵循隨機、等量、多點混合的原則，采用S形布點取樣，每塊田地取15個小樣混合，土樣取自0 ～ 20 cm深的耕層土，共3份平行樣。一部分土樣裝入無菌紙袋，立即帶回實驗室，研磨過0.9 mm(20目)篩后于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物的分析；另一部分土樣風干，用于測定土壤酶活性。采樣煙田分布于相同的農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)域內(nèi)，施肥和田間管理均按照當?shù)責煵萆a(chǎn)技術(shù)規(guī)程進行，烤煙品種均為中煙100。

1.2 試驗方法

1.2.1土壤酶活性的測定。淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶活性的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]。

1.2.2土壤微生物種群、數(shù)量的常規(guī)分離分析。菌分離采用1/10 TSA培養(yǎng)基，真菌分離采用PDA+Kana(卡那霉素0.005 mg·ml-1)培養(yǎng)基，放線菌分離采用高氏一號培養(yǎng)基。土壤細菌、真菌、放線菌的計數(shù)采用稀釋涂抹平板法[15]。

1.2.3土壤樣品DNA的提取。本實驗室方法提取土壤樣品總DNA，稱取大約3 g土樣于10 mL離心管中；加入6 mL TENP buffer(50 mmol·L-1Tris，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1NaCl，0.01 g·mL-1PVPP，pH值10),渦旋震蕩10 min，12 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液；沉淀中加入6 mL PBS buffer(8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于1 L水，pH值7.4)，渦旋震蕩5 min，12 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液,沉淀備用；將沉淀中加入3 mL土壤DNA提取液(100 mmol·L-1Tris·HCl，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，1.5 mol·L-1NaCl，1%CTAB，2%CaCl，1 ug·mL-1BSA，pH值8.0)，震蕩混勻后置于超低溫冰箱中冷凍15 min，65℃水浴5 min,然后充分反復凍融3次。向反復凍融的土壤中加入溶菌酶(100 mg·mL-1，50 uL)、蝸牛酶(20 mg·mL-1，100 uL)，37℃水浴1 h,再加入2.0 mg(100 mg·Ml-1，吸取20 uL)蛋白酶K，37℃水浴30 min；加入500 uL裂解液(20%SDS)，人工輕緩顛倒幾次至液體變粘稠，65℃水浴1 h，12 000 r·min-1(4℃)離心5 min，收集上清液；將上清液中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，冰浴上人工晃動5min,取上清液；在上清液中加入0.5倍體積25%PEG8000，4℃放置2 h(或過夜沉淀)；12 000 r·min-1(4℃)離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌2次，8 000 r·min-1( 4℃)離心5 min,沉淀室溫晾干，根據(jù)DNA得量溶于60 uL～100 uL TE 緩沖液。

1.2.4細菌16S rDNA基因V3區(qū)的擴增。據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公開的細菌基因組16S保守序列設計了2對細菌通用引物,并進行巢式PCR擴增。其中第一輪PCR的引物對為Eubac 10F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和Eubac 1507R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，產(chǎn)物長度約為1.5 kbp。擴增反應體系25 ul，PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，28個循環(huán)；72℃總延伸10 min。第二輪擴增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以細菌16S rDNA V3區(qū)引物對BV34F(5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’)和BV56GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCGAATTAAACCACATGCTCCAGCAATTAAACCACATGCTCCA-3’)，產(chǎn)物長度約為400 bp。第2輪PCR反應體系50 ul，PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃ 40 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，28個循環(huán)；72℃總延伸10 min。

1.2.5變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。GGE參數(shù)為：變性劑(尿素及去離子甲酰胺)梯度40%到60%，8%的聚丙烯酰胺凝膠。點樣量為30 uL已濃縮PCR產(chǎn)物，電泳在60℃，1倍 TAE(pH 8.0)緩沖液，100V電壓下進行10 h。電泳結(jié)束后在EB中染色15 min，并用BIO IMAGING(美國UVP GelDoc-It Imaging Systems)的凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析。驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)字化處理，并進行Duncan法方差分析；用Quantity One軟件(Bio-Rad)對DGGE圖譜進行數(shù)字化處理[16]，按照如下公式計算多樣性指數(shù)Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh多樣性指數(shù)[17]。其中：s——每泳道中的條帶數(shù)量；Pi——泳道中第i條帶灰度(height of the peak)占該泳道總灰度的比例；ni——泳道中第i條帶灰度；N——每泳道中所有條帶的總灰度。

Simpson指數(shù)：

Shannon-Wiener指數(shù)：

McIntosh多樣性指數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對土壤酶活性的影響

連作1 a-8 a土壤蔗糖酶活性整體呈現(xiàn)先升高后下降再略有回升的趨勢，連作2 a時土壤蔗糖酶活性達到最大值，之后顯著降低(p<0.01)，并在連作第6 a達到最低，到第8 a又顯著增加，見圖1。此外，連作2 a、3 a蔗糖酶活性與其他連作年限相比差異達到極顯著水平(p<0.01)，而連作4 a、5 a和6 a的蔗糖酶活性并無顯明差異，連作8 a蔗糖酶活性與連作5 a、6 a相比達到極限著差異(p<0.01)。

圖1 不同連作年限土壤酶活性的變化Fig.1 The changes of soil enzyme activities during different continuous cropping years注：酶和淀粉酶標于主坐標軸，纖維素酶標于次坐標軸。

土壤淀粉酶活性呈先升高后降低的趨勢，在連作2 a時達到最大值，與連作1a酶活性相比并無顯著差異，但與其它連作年限相比差異達到顯著水平(p<0.05)；連作4 a-8 a的土壤淀粉酶活無顯著性差異。

土壤纖維素酶活性在連作1 a-3 a時劇烈下降，連作1 a、2 a時的纖維素酶活性與其他連作年限相比存在顯著差異(p<0.05)；連作1 a時最高，連作年限達到3 a以后，土壤纖維素酶活性呈相對穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 不同連作年限的植煙土壤微生物學特征常規(guī)分離結(jié)果

土壤細菌數(shù)量隨連作年限的延長，總體呈現(xiàn)減少的趨勢，見圖2；且連作1 a的煙田土壤細菌數(shù)量最多，與其他連作年限(連作5 a除外)有顯著差異(p<0.05)；連作5 a的細菌數(shù)量與連作3 a、6 a和8 a達到顯著差異(p<0.05)。

從圖2可以看出，土壤真菌隨著連作年限的增加其數(shù)量變化趨勢為升高-降低-升高-降低；連作3 a之前，土壤真菌數(shù)量逐漸增多，連作4 a、5 a數(shù)量有所增加，5 a之后再次減少。其中，連作3 a真菌數(shù)量與連作1 a和8 a達到顯著差異(p<0.05)；連作6 a與8 a達到顯著差異(p<0.05)。

圖2 不同連作年限土壤微生物數(shù)量的變化Fig.2 The changes of soil microbial number during different continuous cropping years

由圖2可知，隨著連作年限的延長，土壤放線菌數(shù)量總體上逐漸減少，其變化趨勢與細菌相似，且連作3 a后，其數(shù)量顯著下降，之后趨于平穩(wěn)；試驗結(jié)果表明，連作1 a、2 a和3 a放線菌數(shù)量接近同一水平，且與其他連作年限差異顯著(p<0.05)；連作4 a、5 a、6 a和8 a之間無顯著性差異(p<0.05)。

2.3 不同連作年限土壤細菌的PCR擴增

細菌16S rDNA的第一輪PCR擴增條帶亮度高，大小約為1 500 bp，陰性對照無條帶，且無非特異性擴增，見圖3。第二輪擴增的細菌V3區(qū)條帶片段的大小約為400 bp，陰性對照無條帶，且無非特異性擴增，見圖4，能夠滿足進一步的DGGE分析要求。

2.4 不同連作年限煙田土樣的細菌的DGGE分析

連作1 a-8 a的DNA泳道中條帶的個數(shù)和亮度不一，說明不同連作年限土壤樣品的細菌多樣性不同，見圖5。連作1 a-8 a的土樣中多樣性條帶數(shù)量在11條～17條不等，且隨著連作年限的延長，條帶數(shù)逐漸減少。其中連作1 a的條帶數(shù)最多，達到17條，連作8 a的條帶數(shù)最少，只有11條，但連作5 a樣品的條帶數(shù)多于4 a和6 a樣品，5 a后繼續(xù)減少。說明土壤細菌豐富度(S)隨植煙年限的增加呈下降趨勢。

Shannon指數(shù)主要反映物種的豐富度,描述了土壤微生物群落功能多樣性相對多度的信息。由表1可以看出，不同連作年限之間的土樣的微生物的Shannon指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)，且連作1 a、2 a其值較大，之后有降低的趨勢，而到連作5a時，又有所上升。Simpson指數(shù)反映了群落中常見的物種多少。不同連作年限之間土樣的微生物的Simpson指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。Mcintosh多樣性指數(shù)基于群落物種多維空間上的多樣性指數(shù)。不同連作年限之間的土樣的微生物的Mcintosh指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。

圖3 連作1 a-8 a土樣細菌總DNA的第一輪PCR擴增結(jié)果Fig.3 The first round PCR amplification result of soil bacteria DNA during different continuous cropping years of 1-8注：M：DL 2000 DNA Marker；1 a-8 a分別表示連作1年- 8年的煙田土樣；N：陰性對照

圖4 連作1 a-8 a土樣細菌總DNA的第二輪PCR擴增結(jié)果Fig.4 The second round PCR amplification result of soil bacteria DNA during different continuous cropping years of 1-8注：M：DL 2000 DNA Marker；1 a-8 a分別表示連作1年-8年的煙田土樣；N：陰性對照

連作年限Continuous years香農(nóng)指數(shù)Shannon(H)辛普森指數(shù)Simpson(J)McIntosh多樣性指數(shù)McIntosh(Dmc)1 a4.066 6 A0.939 6 A0.760 4 A2 a3.973 0 B0.935 2 B0.752 2 B3 a3.877 3 D0.930 8 D0.743 7 D4 a3.659 7 F0.918 8 F0.721 7 F5 a3.968 3 C0.934 8 C0.751 5 C6 a3.674 5 E0.920 5 E0.725 0 E8 a3.420 3 G0.904 3 G0.698 0 G

圖5 不同連作年限煙田土壤細菌群落V3區(qū)的DGGE指紋圖譜Fig.5 The DGGE finger-print of soil microbial V3 area during different continuous cropping years注：1 a-8 a分別表示連作1年-8年的煙田土樣

3 討論與結(jié)論

土壤酶作為衡量土壤健康狀況的一個必不可少的土壤微生物學指標之一，越來越受到人們的高度重視，許多研究者在連作對土壤酶影響方面也進行了很多研究。試驗研究表明，短期連作(連作2 a-3 a)可使土壤淀粉酶和蔗糖酶活性升高；連作3 a以上時，兩種酶活性顯著下降，處于較低水平，與賈新民等[18]、何川等[19]的結(jié)果相似；而纖維素酶呈持續(xù)下降趨勢，結(jié)果與胡汝曉等[20]研究結(jié)果一致。

土壤微生物在反映土壤質(zhì)量狀況上有較高的靈敏度，是近年來研究土壤健康狀況不可或缺的生物學指標[21]。眾多研究表明，連作可使土壤微生物數(shù)量和類群發(fā)生變化[22-24]。試驗采用常規(guī)分離培養(yǎng)和分子技術(shù)兩種手段，研究不同連作年限間土壤微生物多樣性的變化。結(jié)果表明隨著連作年限的延長土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量逐漸減少，其中細菌數(shù)量降低尤為明顯，對連作表現(xiàn)出較高的敏感性,放線菌對連作反應稍滯后,至第3 a時開始呈現(xiàn)降低趨勢，該結(jié)果與胡元森等[25]的研究結(jié)果極其相似；放線菌數(shù)量變化之所以較穩(wěn)定，可能是由于放線菌與細菌相比，生長較慢、受農(nóng)業(yè)技術(shù)措施的影響小也表現(xiàn)較慢的緣故[26]。而真菌數(shù)量的變化與與細菌數(shù)量變化村存在此消彼長的關(guān)系，與古戰(zhàn)朝等[27]結(jié)果相似?？傮w上，隨著連作年限的增加，土壤微生物種類和數(shù)量、土壤酶活性呈下降趨勢，細菌和放線菌在微生物中所占的比例也呈下降趨勢，而真菌所占比例有所上升。一方面可能是因為連作導致土壤中養(yǎng)分含量失衡，造成土壤貧瘠，更適宜真菌生長[28]；另一方面可能是由于土壤根系分泌物抑制土壤微生物生長發(fā)育造成的，而細菌和放線菌對此反應較為敏感，真菌對此反應不太敏感，導致土壤微生物中真菌比例增加。

根據(jù)細菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中條帶的位置和亮度的數(shù)字化結(jié)果計算了細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指標。連作1 a -8 a的條帶數(shù)11條 ～ 17條不等，且隨著植煙年限的延長，條帶數(shù)逐漸減少，而到達5 a時條帶數(shù)增加，5 a后減少。不同連作年限的變化規(guī)律相同，均隨著連作年限的延長，土樣的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)均在不斷下降，而到第5 a又有所回升，之后繼續(xù)下降，到第8 a降到最低。這與細菌的常規(guī)分離培養(yǎng)方法結(jié)果吻合。

煙草連作對土壤微生物數(shù)量的影響與對土壤酶活性的影響具有一致性?？赡苁怯捎跓煵葸B作引起了土壤微生物主要類群發(fā)生定向改變，進而導致主要土壤酶活性的定向改變，這種改變將導致土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化受到影響。

研究認為煙草連作年限應在3 a以下，此年限內(nèi)土壤微生物的多樣性和活性較高。

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