抵當(dāng)湯對阿爾茨海默病大鼠腦組織端粒酶活性的影響

王康鋒　張立娟　孫西慶等

[摘要] 目的 觀察抵當(dāng)湯對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠腦組織端粒酶活性及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 方法 40只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組和抵當(dāng)湯組。采用右側(cè)海馬注射Aβ25-35方法制備AD大鼠模型，治療組采用抵當(dāng)湯治療，對照組給予多奈哌齊，均連續(xù)灌胃給藥，療程為8周，采用跳臺實驗觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變。實驗結(jié)束后處死大鼠，采用ELISA檢測腦組織端粒酶活性。 結(jié)果 實驗結(jié)束后各用藥組逃避潛伏期較模型組明顯延長，錯誤次數(shù)明顯減少（P<0.05，P<0.01），抵當(dāng)湯組較多奈哌齊組錯誤次數(shù)減少更明顯（P<0.05）；與模型組比較，抵當(dāng)湯組和多奈哌齊組腦組織端粒酶活性明顯提高（P<0.05，P<0.01），抵當(dāng)湯組較多奈哌齊組提高更明顯（P<0.05）。 結(jié)論 抵當(dāng)湯可顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與該方提高大鼠腦組織端粒酶活性有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 抵當(dāng)湯；阿爾茨海默??；端粒酶；學(xué)習(xí)記憶

[中圖分類號] R289.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）04（b）-0011-03

[Abstract] Objective To observe the influence of Didang Decoction on telomerase activity and the ability of learning and memory of brain tissue in rats with Alzheimer disease（AD）. Methods 40 male Wistar rats were randomly divided into the pseudo operation group，model group，donepezil group and Didang decoction group.AD rats model was made by the method of injecting A beta 25-35 in the right hippocampus.The Didang decoction group was treated by used Didang decoction， the donepezil group was treated by donepezil，the rats，all groups were given continuous intragastric administration for 8 weeks，after the medication step down test was performed to observe the changes of learning and memory ability in different groups of rats.After the experiment，the rats were sacrificed and ELISA was used to detect telomerase activity in brain tissue. Results Compared with the model group，the escape latent period of rats in each treatment group was prolonged significantly （P<0.05，P<0.01），error number was decreased obviously，it was more significantly decreased in the Didang decoction group compared with that in the donepezil group（P<0.05）；compared with the model group，the telomerase activity of the Didang decoction group and donepezil group increased significantly （P<0.05，P<0.01），and it was more significantly increased in Didang decoction group compared with that in the donepezil group （P<0.05）. Conclusion Didang decoction can significantly improve the learning and memory ability of rats with AD，and its mechanism may be related to this prescription increasing telomerase activity in brain tissue of rats.

[Key words] Didang decoction；Alzheimer disease；Telomerase；Learning and memory

抵當(dāng)湯是張仲景創(chuàng)立的理血名方，至今仍在臨床被廣泛使用，本方由桃仁、大黃、水蛭、虻蟲組成，原為下焦蓄血證所設(shè)。經(jīng)過歷代醫(yī)家的不斷發(fā)展，本方應(yīng)用范圍不斷擴大，目前已被應(yīng)用于泌尿系疾病、心腦血管疾病、婦科疾病等數(shù)十種疾病。我們受本方主治“如狂”“喜忘”等癥狀的啟發(fā)，采用抵當(dāng)湯治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）取得了滿意的效果，總有效率達80.0%，明顯優(yōu)于西藥對照組[1]，但本方治療AD的基礎(chǔ)研究目前還十分薄弱，本研究通過Aβ25-35海馬區(qū)注射建立AD動物模型并用抵當(dāng)湯進行干預(yù)，觀察本方對AD大鼠腦組織端粒酶（telomerase）活性及學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其療效機制。

1材料與方法

1.1 藥物與試劑

抵當(dāng)湯藥物組成：桃仁12 g，水蛭6 g，虻蟲6 g，大黃9 g。水煎后濃縮至每毫升含生藥3 g備用。鹽酸多奈哌齊片[安理申，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號130536A]。Aβ25-35購于Sigma公司。大鼠端粒酶（TE）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 儀器

腦立體定向儀（江灣1號C型，上海川沙花木農(nóng)機廠），酶標儀（352型，芬蘭Labsystems Multiskan MS），洗板機（AC8型，芬蘭Thermo Labsystems），微量高速離心機（TG16W，湖南長沙平凡儀器儀表有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9080型，青島正恒試驗設(shè)備有限公司），大鼠跳臺儀（自制）。

1.3 動物

雄性Wistar大鼠40只，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及給藥 將40只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、抵當(dāng)湯組，每組各10只。治療藥物及對照藥物參考臨床用藥情況，按成人（60 kg）日用藥量的10倍量折算成大鼠使用劑量。造模次日開始灌胃給藥，1次/d。假手術(shù)組及模型組用等體積生理鹽水灌胃，療程均為8周。

1.4.2 動物模型的建立 參考文獻[2]方法大鼠用10%水合氯醛（3～3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉后頭部固定于立體定向儀，常規(guī)消毒后暴露顱骨，以右側(cè)海馬為注射區(qū)，定位坐標：前囟后3.0 mm，中線右側(cè)2.0 mm，硬膜下2.6 mm。將1 μl聚集態(tài)Aβ25-35（10 μg/μl）緩慢注入，注射時間5 min，留針5 min，術(shù)后縫合切口。

1.4.3 跳臺實驗 跳臺實驗于造模后及用藥后各進行1次。訓(xùn)練時將大鼠分別放入自制大鼠跳臺儀內(nèi)，先適應(yīng)環(huán)境3 min，然后通以36 V交流電，大鼠受電擊后，正常反應(yīng)是跳上跳臺以逃避電擊。訓(xùn)練5 min，記錄大鼠第一次跳下時觸電潛伏期，并記錄5 min內(nèi)觸電次數(shù)作為錯誤反應(yīng)次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后重新測試，記錄第一次跳下平臺的觸電潛伏期和5 min內(nèi)觸電次數(shù)，此即記憶保持成績。

1.4.4 端粒酶活性檢測 大鼠處死后快速取出大腦，以生理鹽水制成10%組織勻漿用于檢測端粒酶活性，采用ELISA，具體方法參考試劑盒說明書進行。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件作統(tǒng)計分析，樣本均數(shù)間比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組跳臺實驗結(jié)果的比較

實驗結(jié)束后各用藥組逃避潛伏期均較模型組明顯延長，同時5 min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯減少（P<0.05，P<0.01），抵當(dāng)湯組錯誤次數(shù)減少更明顯，與多奈哌齊組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），逃避潛伏期雖較多奈哌齊組延長，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

3 討論

AD是一種發(fā)生于中老年的原發(fā)性腦退行性變性疾病。本病在老年人群中發(fā)病率高，是現(xiàn)代社會最常見的老年性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，嚴重威脅了老年人的生命和健康。目前中國60歲以上人群AD發(fā)病率已高達3%～5%[3]，全球每年新增加460萬AD患者[4]。隨著世界人口老齡化程度的提高，AD患病率不斷增高，本病引起的社會問題和經(jīng)濟問題必將日益嚴峻。

AD既往雖然有膽堿能損傷[5]、自由基[6]、興奮性氨基酸毒性[7]、炎癥免疫[8]、細胞凋亡[9]等假說，但均未能完全闡明其發(fā)病機制，近年來端粒酶與AD的關(guān)系備受關(guān)注。端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體，是一種依賴RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，在維持端粒的長度方面起重要作用。在AD發(fā)病與患者PBLs端粒長度的研究中，Jenkins等[10]對比了18例Down綜合征婦女的PBLs端粒長度，提示合并有AD的患者端粒較短。Honig等[11]也觀察到了AD組PBLs端粒較短，同時發(fā)現(xiàn)端粒長度越短，研究對象死亡率越高。端粒與認知功能的關(guān)系亦有初步研究，Valdes等[12]對382名雙胞胎婦女的研究發(fā)現(xiàn)具有較長端粒的學(xué)習(xí)記憶能力較強，端粒較短者易出現(xiàn)認知功能的下降。Yaffe等[13]對2734個非AD老人進行了7年的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)端粒較長者認知功能評定得分下降最少，端粒較短者得分下降較多，認為PBLs端粒長度或許可以作為評價認知功能狀態(tài)的指標之一。

抵當(dāng)湯是張仲景治療下焦蓄血證的經(jīng)典方劑，臨床廣為應(yīng)用，如《傷寒論》第237條云“陽明證，其人喜忘者，必有蓄血，所以然者，本有久瘀血，故令喜忘，屎雖硬，大便反易，其色必黑者，宜抵當(dāng)湯下之?！北痉街髦蔚摹叭缈瘛薄跋餐钡劝Y狀與AD的臨床表現(xiàn)極為相似，我們以此為借鑒，臨床上采用本方治療AD取得了滿意的療效[1，14]。關(guān)于本方治療AD的作用機制也有部分學(xué)者進行了研究，抵當(dāng)湯能顯著提高老年大鼠的記憶保存率，具有明顯的改善記憶作用[15]，目前認為其療效與改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化及保護內(nèi)皮功能等作用有關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，抵當(dāng)湯可以明顯提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，延長大鼠跳臺潛伏期，減少5 min內(nèi)錯誤次數(shù)，與文獻報道結(jié)果一致[15]。同時本方可以顯著提高AD大鼠腦組織端粒酶活性，明顯優(yōu)于對照藥物多奈哌齊，這可能是抵當(dāng)湯治療AD的機制之一。

[參考文獻]

[1] 王康鋒，張立娟.抵當(dāng)湯加減治療老年性癡呆療效觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（10）：74-75.

[2] 蔡高梅，畢建忠.TRAIL在Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠海馬組織中的表達[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2008，25（10）：1856-1858.

[3] 陳可冀.老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床研究進展思考[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18（6）：324 -326.

[4] Thomas P，F(xiàn)eneeh M.A review of genome mutation and Alzheimer′s disease[J].Mutagenesis，2007，22（1）：15-33.

[5] 張成，朱闖新，趙東紅，等. 阿爾茨海默病與膽堿能系統(tǒng)損害[J].沈陽部隊醫(yī)藥，2011，24（6）：433-435.

[6] 范紅波.氧自由基在老年癡呆發(fā)病機制中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2012，14（4）：130-132.

[7] 周磊，楊文明，孫林娟. 智腦膠囊對實驗性AD模型大鼠行為學(xué)及腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（3）：271-274.

[8] 左麗君，張巍.神經(jīng)免疫炎癥與阿爾茨海默病[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（14）：6547-6550.

[9] 陳雪，孫婧霞，蔣常文.Bcl-2、Caspase-3 與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20（9）：1177-1179.

[10] Jenkins EC，Velinov MT，Ye L，et al.Telomere shortening in T lymphocytes of older individuals with Down syndrome and dementia[J]. Neurobiol Aging，2006，27（7）：941-945.

[11] Honig LS，Schupf N，Lee JH，et al.Shorter telomeres are associated with mortality in those with APOE epsilon4 and dementia[J].Ann Neurol，2006，60（2）：181-187.

[12] Valdes AM，Deary IJ，Gardner J，et al.Leukocyte telomere length is associated with cognitive performance in healthy women[J].Neurobiol Aging，2010，31（6）：986-992.

[13] Yaffe K，Lindquist K，Kluse M，et al.Telomere length and cognitive function in community-dwelling elders：findings from the Health ABC Study[J].Neurobiol Aging，2011，32（11）：2055-2060.

[14] 王康鋒.老年性癡呆病機及治法探討[J].中國民間療法，2011，19（10）：8-9.

[15] 夏衛(wèi)軍，金妙文，張莉.抵當(dāng)湯治療老年期血管性癡呆的實驗研究[J].中藥藥理與臨床，2000，16（4）：6-8.

[16] 施雪音.抵當(dāng)湯與桃核承氣湯抗衰老作用比較的實驗研究[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[17] 溫曉輝，潘麗，王鑫國，等.抵當(dāng)湯對去卵巢大鼠血脂異常及ET-1mRNA，VCAM-1mRNA表達的影響[J].河北中醫(yī)，2010，32（5）：751.

（收稿日期：2014-03-14 本文編輯：許俊琴）

[3] 陳可冀.老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床研究進展思考[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18（6）：324 -326.

[4] Thomas P，F(xiàn)eneeh M.A review of genome mutation and Alzheimer′s disease[J].Mutagenesis，2007，22（1）：15-33.

[5] 張成，朱闖新，趙東紅，等. 阿爾茨海默病與膽堿能系統(tǒng)損害[J].沈陽部隊醫(yī)藥，2011，24（6）：433-435.

[6] 范紅波.氧自由基在老年癡呆發(fā)病機制中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2012，14（4）：130-132.

[7] 周磊，楊文明，孫林娟. 智腦膠囊對實驗性AD模型大鼠行為學(xué)及腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（3）：271-274.

[8] 左麗君，張巍.神經(jīng)免疫炎癥與阿爾茨海默病[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（14）：6547-6550.

[9] 陳雪，孫婧霞，蔣常文.Bcl-2、Caspase-3 與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20（9）：1177-1179.

[10] Jenkins EC，Velinov MT，Ye L，et al.Telomere shortening in T lymphocytes of older individuals with Down syndrome and dementia[J]. Neurobiol Aging，2006，27（7）：941-945.

[11] Honig LS，Schupf N，Lee JH，et al.Shorter telomeres are associated with mortality in those with APOE epsilon4 and dementia[J].Ann Neurol，2006，60（2）：181-187.

[12] Valdes AM，Deary IJ，Gardner J，et al.Leukocyte telomere length is associated with cognitive performance in healthy women[J].Neurobiol Aging，2010，31（6）：986-992.

[13] Yaffe K，Lindquist K，Kluse M，et al.Telomere length and cognitive function in community-dwelling elders：findings from the Health ABC Study[J].Neurobiol Aging，2011，32（11）：2055-2060.

[14] 王康鋒.老年性癡呆病機及治法探討[J].中國民間療法，2011，19（10）：8-9.

[15] 夏衛(wèi)軍，金妙文，張莉.抵當(dāng)湯治療老年期血管性癡呆的實驗研究[J].中藥藥理與臨床，2000，16（4）：6-8.

[16] 施雪音.抵當(dāng)湯與桃核承氣湯抗衰老作用比較的實驗研究[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[17] 溫曉輝，潘麗，王鑫國，等.抵當(dāng)湯對去卵巢大鼠血脂異常及ET-1mRNA，VCAM-1mRNA表達的影響[J].河北中醫(yī)，2010，32（5）：751.

（收稿日期：2014-03-14 本文編輯：許俊琴）

[3] 陳可冀.老年性癡呆基礎(chǔ)和臨床研究進展思考[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18（6）：324 -326.

[4] Thomas P，F(xiàn)eneeh M.A review of genome mutation and Alzheimer′s disease[J].Mutagenesis，2007，22（1）：15-33.

[5] 張成，朱闖新，趙東紅，等. 阿爾茨海默病與膽堿能系統(tǒng)損害[J].沈陽部隊醫(yī)藥，2011，24（6）：433-435.

[6] 范紅波.氧自由基在老年癡呆發(fā)病機制中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2012，14（4）：130-132.

[7] 周磊，楊文明，孫林娟. 智腦膠囊對實驗性AD模型大鼠行為學(xué)及腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（3）：271-274.

[8] 左麗君，張巍.神經(jīng)免疫炎癥與阿爾茨海默病[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（14）：6547-6550.

[9] 陳雪，孫婧霞，蔣常文.Bcl-2、Caspase-3 與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2013，20（9）：1177-1179.

[10] Jenkins EC，Velinov MT，Ye L，et al.Telomere shortening in T lymphocytes of older individuals with Down syndrome and dementia[J]. Neurobiol Aging，2006，27（7）：941-945.

[11] Honig LS，Schupf N，Lee JH，et al.Shorter telomeres are associated with mortality in those with APOE epsilon4 and dementia[J].Ann Neurol，2006，60（2）：181-187.

[12] Valdes AM，Deary IJ，Gardner J，et al.Leukocyte telomere length is associated with cognitive performance in healthy women[J].Neurobiol Aging，2010，31（6）：986-992.

[13] Yaffe K，Lindquist K，Kluse M，et al.Telomere length and cognitive function in community-dwelling elders：findings from the Health ABC Study[J].Neurobiol Aging，2011，32（11）：2055-2060.

[14] 王康鋒.老年性癡呆病機及治法探討[J].中國民間療法，2011，19（10）：8-9.

[15] 夏衛(wèi)軍，金妙文，張莉.抵當(dāng)湯治療老年期血管性癡呆的實驗研究[J].中藥藥理與臨床，2000，16（4）：6-8.

[16] 施雪音.抵當(dāng)湯與桃核承氣湯抗衰老作用比較的實驗研究[D].杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[17] 溫曉輝，潘麗，王鑫國，等.抵當(dāng)湯對去卵巢大鼠血脂異常及ET-1mRNA，VCAM-1mRNA表達的影響[J].河北中醫(yī)，2010，32（5）：751.

（收稿日期：2014-03-14 本文編輯：許俊琴）