萌動小麥生化指標(biāo)及Mixolab糊化特性的變化

李興軍 姜 平 路子顯

(國家糧食局科學(xué)研究院,北京 100037)

小麥?zhǔn)斋@前穗上發(fā)芽，在我國長江流域的山谷小麥產(chǎn)區(qū)、東北春小麥產(chǎn)區(qū)及華北、西北的冬小麥產(chǎn)區(qū)，時有發(fā)生。不正常年份，我國小麥的穗發(fā)芽，面積能夠達(dá)到2 471萬hm2，占我國小麥種植面積的83%[1]。有研究表明， 90 g小麥中如果有一粒小麥嚴(yán)重發(fā)芽，就嚴(yán)重地影響測定樣品的降落數(shù)值和糊化值[2]。因此建立快速有效的芽麥檢測方法，選育抗穗發(fā)芽的小麥品種，是糧食工作者的重要目標(biāo)之一。閆長生等[3]采用收獲時種子發(fā)芽率和面粉降落數(shù)值法于2000～2002年評價了我國小麥主產(chǎn)區(qū)1950年以來主要推廣的781個品種(系)的穗發(fā)芽抗性，發(fā)現(xiàn)穗發(fā)芽抗性20世紀(jì)90年代育成的品種與80年代的相近，但是明顯弱于50～70年代育成的品種。一個重要原因是進(jìn)入80年代，出粉率高的白麥品種受到偏愛，白麥抗穗發(fā)芽能力不如紅麥。從白粒小麥品種或特殊種質(zhì)資源選育抗穗發(fā)芽品種進(jìn)展緩慢，于是利用基因工程技術(shù)反義導(dǎo)入α-淀粉酶活性的調(diào)控基因來加快抗穗發(fā)芽育種[4-6]。

Fox等[7]指出優(yōu)質(zhì)小麥面粉包含有α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶等多種酶。其中的大多酶在不發(fā)芽、含水率低的完整粒小麥中活性很低，加入水時才能被活化，然而他們對面粉、面包及其他加工品的功能和營養(yǎng)屬性起重要影響。小麥萌動(發(fā)芽)時，蛋白酶活性增加了17倍[8]，而蛋白質(zhì)及游離氨基酸含量報道較少。本試驗分析了萌動小麥游離氨基酸、總蛋白質(zhì)及水溶性糖類的含量、面團(tuán)Mixolab糊化特性的變化，以期對我國芽麥檢測及小麥營養(yǎng)品質(zhì)的評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及準(zhǔn)備

采用的小麥樣品如表1。芽麥制備方法如下：100粒小麥在培養(yǎng)皿打濕的濾紙上于25 ℃萌動48 h，然后60 ℃烘干，40目粉碎，4 ℃保存。大量小麥樣品在潮濕的雙層紗布上萌動，供Mixolab 面團(tuán)糊化特性測定。

表1 采用的小麥樣品

注：發(fā)芽率在20 ℃測定；LSD test,P=0.05,同一列相同字母表示品種之間差異不顯著。

1.2 儀器設(shè)備

肖邦Mixolab混合實驗儀、肖邦SD matic儀:特雷首邦(北京)貿(mào)易有限公司。

1.3 試劑

含內(nèi)切和外切酶活的蛋白酶來自Bacillusamy-loliquefaciens，僅含內(nèi)切活性的蛋白酶來自Aspergillus melleus：Sigma公司。

1.4 樣品制備

小麥樣品粉碎(40目篩)后，稱取1.0 g面粉于50 mL塑料離心管中，加入15 mL己烷，充分渦旋，蓋上蓋子。常溫下振蕩3 h，在4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取沉淀并在通風(fēng)櫥將己烷揮發(fā)掉。然后在沉淀中加入15 mL無氨蒸餾水，研磨，在室溫下提取5 min, 在4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，上清液即為提取液。

1.5 游離氨基酸含量測定

按照文獻(xiàn)[9]方法。吸取0.50 mL樣品提取液于10 mL帶塞刻度試管中，依次加入無氨蒸餾水0.25 mL、乙酸-乙酸鈉緩沖液0.5 mL、3% 茚三酮0.5 mL, 混勻，蓋上塞子。置沸水浴中12 min，冷卻，立即于每管中加入95%乙醇5 mL，塞好塞子，劇烈渦旋試管，促進(jìn)加熱時形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色。最終溶液顯示藍(lán)紫色，于570 nm波長下測其吸光值。以亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，游離氨基酸含量單位是μg氨基態(tài)氮/g 干重(dw)。

1.6 還原糖和總糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)方法[10]。800 μL提取液加入4.4 mmol/L DNS反應(yīng)液600 μL，混勻，沸水浴5 min。冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至10 mL，測定D540。以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偺呛坎捎帽椒?硫酸方法[11]。0.5 mL提取液加入5% 苯酚水溶液0.5 mL，混勻，再加入濃硫酸3 mL，混勻，冷卻后測定D490。

1.7 蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶水解

含有內(nèi)切和外切活性的Bacillusamyloliquefaciens蛋白酶，酶解條件是50 mg樣品中加入2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液pH 7.5、酶活0.106 U，37 ℃酶解3 h。Aspergillusmelleus內(nèi)切蛋白酶酶解條件是50 mg樣品加入2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液pH 7.5、酶活0.120 U，37 ℃酶解3 h。酶解產(chǎn)物測定游離氨基酸含量。

1.8 破損淀粉含量測定

破損淀粉含量采用肖邦公司SD matic儀器測定。取1 g小麥粉樣品放到儀器樣品小斗中，在反應(yīng)杯中加入1滴95%乙醇、3 g硼酸、3 g碘化鉀和120 mL水。儀器會自動把反應(yīng)杯中的溫度上升到35 ℃，然后面粉自動落入反應(yīng)杯中。根據(jù)溶液中殘留碘的濃度，儀器自動計算出小麥粉中損傷淀粉的含量，以UCD單位表示。最終的小麥粉破損淀粉考慮含水率、蛋白質(zhì)含量的影響，以UCDC單位表示。蛋白含量測定采用全自動氮元素快速分析儀。

1.9 Mixolab面團(tuán)糊化特性測定

小麥粉糊化特性采用Mixolab混合實驗儀分析，進(jìn)行恒量加水試驗。水分基數(shù)14%濕基；參數(shù)按照Rosell等[12]方法，包括目標(biāo)扭矩(1.1±0.5)Nm，轉(zhuǎn)速80 r/min，面團(tuán)重量75 g，和面初始溫度30 ℃，水箱溫度30 ℃，水合作用55%，第1階段30 ℃恒溫8 min，第2階段從30 ℃升溫到90 ℃共15 min，第3階段90 ℃恒溫保持7 min，第4階段從90 ℃降溫至50 ℃ 10 min，第5階段50 ℃恒溫5 min，試驗總時間45 min。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理采用Excel軟件，差異顯著性分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 萌動小麥中游離氨基酸和糖類含量變化

從表2～表4看出，6個小麥品種萌動后，游離氨基酸總量均顯著增加。除了順義9843，其他5個品種的水溶性還原糖含量在萌動后也顯著增加。對6個小麥品種，萌動前后水溶性總糖含量差異不顯著。

注：LSD test,P=0.05，同一列相同字母表示品種之間差異不顯著，下同。

表3 萌動小麥游離氨基酸及糖類含量

表4 萌動小麥游離氨基酸和還原糖增加的倍數(shù)

2.2 小麥萌動后外源蛋白酶對面粉蛋白的降解作用

為了探討萌動小麥對外源蛋白酶降解的敏感程度，采用微生物蛋白酶處理萌動小麥面粉。從表5～表6看出，小麥萌動后，加入Bacillusamyloliquefaciens蛋白酶(含內(nèi)切和外切酶)，產(chǎn)生大量游離氨基酸，但是小麥品種之間、萌動前后之間游離氨基酸總量差異不顯著。加入Aspergillusmelleus蛋白酶(僅含內(nèi)切酶)，酶解產(chǎn)生的游離氨基酸數(shù)量約是加入Bacillusamyloliquefaciens蛋白酶酶解產(chǎn)物的0.14～0.23倍；與未萌動小麥比較，除了趙莊2號，萌動的其他5個小麥品種被內(nèi)切蛋白酶酶解產(chǎn)生的游離氨基酸含量顯著增加。

表5 蛋白酶(內(nèi)切+外切)降解萌動小麥粉產(chǎn)生游離氨基酸的量/μg氨基氮/g dw

表6 內(nèi)切蛋白酶酶解萌動小麥粉產(chǎn)生游離氨基酸的量/μg氨基氮/g dw

2.3小麥萌動后蛋白質(zhì)、破損淀粉含量及Mixolab糊化特性的變化

就小麥萌動對蛋白質(zhì)的影響，從表7看出，萌動小麥蛋白含量(%干基)增大。小麥粉中淀粉粒的破損率與小麥硬度及研磨劇烈度有關(guān)，在同樣粉碎條件下，2個硬麥品種周麥16、山東南段破損淀粉含量各是15.07、18.90 UCDC，萌動后稍增加；2個軟麥品種順義9843、趙莊2號破損淀粉含量各是18.54、20.67 UCDC，萌動后顯著減少。說明小麥籽粒萌動48 h對蛋白質(zhì)合成的影響較淀粉晶體結(jié)構(gòu)的影響明顯。

Mixolab曲線能夠提供小麥粉的吸水率、面團(tuán)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)及淀粉糊化信息。從圖1a～圖1b及表8看出，和面恒量加水率對4個品種萌動小麥?zhǔn)?1.6%～64.0%，與對未萌動小麥的63.6%～65.4%相似。C1是30 ℃ 面團(tuán)達(dá)到最大扭矩所需的時間(面團(tuán)形成時間)，萌動小麥<未萌動小麥。4個品種萌動小麥C1稠度峰值(1.09～1.11 Nm)類似未萌動小麥的C1稠度峰值(1.09～1.15 Nm)；和面峰值帶寬對4個品種萌動小麥?zhǔn)?.05～0.10 Nm，對未萌動小麥品種是0.06～0.09 Nm；面團(tuán)穩(wěn)定時間是面粉團(tuán)在最大扭矩保持的時間，對4個品種萌動小麥?zhǔn)?.87～3.78 min，對未萌動小麥?zhǔn)?.03～5.63 min。

表7 小麥粉大量樣品的蛋白質(zhì)及破損淀粉含量

圖1 未萌動小麥與萌動小麥恒量加水Mixolab面團(tuán)糊化特性曲線

表8 Mixolab測定的面團(tuán)糊化特性

注：樣品編號同表7。

C2稠度谷值為機(jī)械和熱約束引起的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)弱化度，高C2稠度谷值表示強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。最初階段過度混合期間面團(tuán)穩(wěn)定性及抗變形能力萌動小麥<未萌動小麥。蛋白網(wǎng)絡(luò)弱化度(C1-C2)萌動小麥>未萌動小麥。

高C3淀粉糊化峰值，表示凝膠形成能力萌動小麥<未萌動小麥。C4淀粉糊化黏度谷值、C5淀粉回生終點值均是萌動小麥<未萌動小麥。有趣的是，與其他小麥品種比較，萌動的順義9843(樣品編號8)小麥淀粉糊化谷值較大，C3-C4表示的內(nèi)源淀粉酶活性(淀粉衰減值)極低，與該品種小麥萌動后還原糖含量不增加相一致。

3 討論

穗發(fā)芽鑒定方法有測定淀粉降解酶的濁度法、二硝基水楊酸(DNS)法、底物染色法及ELISA法、降落數(shù)值法，測定黏度參數(shù)的快速黏度分析儀和布氏黏培儀[13]，檢測脂肪酶的熒光法[14]，以及Donelson等[15]提出的預(yù)凝膠化淀粉處理的α-淀粉酶活法。降落數(shù)值法、快速黏度分析儀和布氏黏培儀都是通過控溫(92～100 ℃)使小麥面粉-水懸浮液達(dá)到凝膠狀態(tài)，再利用內(nèi)源淀粉水解酶使這種凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z態(tài)，測定懸浮液的黏度下降。Mixolab能夠定性面團(tuán)在混合和溫度雙重限制條件下的理化特性，Dapcevic等[16]發(fā)現(xiàn)Mixolab測定值與傳統(tǒng)經(jīng)驗式流變學(xué)設(shè)備粉質(zhì)儀和糊化儀的測定值具有顯著的相關(guān)性。Mixolab儀分析的是面團(tuán)蛋白網(wǎng)絡(luò)弱化程度和淀粉糊化特性[17]。本研究顯示，萌動小麥淀粉糊化峰值和谷值均減小，淀粉回生終點值降低。另外，與其他小麥品種比較，萌動的順義9843小麥淀粉衰減值(C3-C4)表示的內(nèi)源淀粉酶活性是極低的。這個結(jié)果與該小麥品種萌動時DNS法測定的還原糖含量不增加相一致。這說明采用DNS法檢測芽麥還原糖增多，不是芽麥檢測的可靠指標(biāo)。

許多學(xué)者認(rèn)為，小麥籽粒發(fā)生穗發(fā)芽過程中，蛋白水解酶對于小麥品質(zhì)的不利影響不及α-淀粉酶[13]。他們的理由是，蛋白水解酶是一個復(fù)雜的體系，依據(jù)底物分類為內(nèi)肽酶、羧肽酶、氨肽酶及其他肽酶，目前還沒有確切的證據(jù)來判斷蛋白水解酶對小麥品質(zhì)影響的精確程度[13]。本研究則首次表明，小麥萌動后，內(nèi)源蛋白酶解產(chǎn)生顯著量的游離氨基酸，而且快速定氮儀顯示蛋白含量增大，Mixolab儀顯示蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)弱化程度(C1-C2)加大，即說明小麥萌動過程蛋白質(zhì)合成和降解同時存在，游離氨基酸積累。

小麥本身蛋白酶對面團(tuán)形成的調(diào)控作用已經(jīng)爭議了多年，多數(shù)人認(rèn)為他們對面粉蛋白的物理化學(xué)變化起微小作用[18]，可能在于面粉蛋白酶的最佳pH值是4，在較高pH值時酶快速失活，而且 pH、鹽、氧化劑、機(jī)械力對小麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有顯著的影響。在小麥萌動(發(fā)芽)時，蛋白酶活性增加了17倍，以血紅素為底物測定外切蛋白酶活性，他對發(fā)芽變化貢獻(xiàn)很小；以偶氮酪蛋白為底物測定內(nèi)切蛋白酶活性，他貢獻(xiàn)發(fā)芽狀況下的大部分蛋白酶活性[19]。本研究中，萌動小麥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)弱化程度加大，內(nèi)切蛋白酶容易進(jìn)攻小麥貯藏蛋白，產(chǎn)生大量游離氨基酸，用于合成淀粉代謝的蛋白酶類。

4 結(jié)論

萌動小麥面粉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)弱化程度加大，游離氨基酸總量顯著增加，以及淀粉糊化峰值和谷值降低，可以作為芽麥及其面粉質(zhì)量評價的參考依據(jù)。

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