豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及高免卵黃抗體的研制

丁雨善，翟洪月，李明亮，鮑 印，楊德全，李 娜，姚倫廣，闞云超，冷超糧

(南陽師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室/南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心，河南 南陽473000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是目前在豬群中普遍存在的一種傳染性病原，引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVADs)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等(PMWS)[1]。臨床表現(xiàn)包括消瘦、呼吸困難、腹瀉和黃疸等[2]。此外，PCV2還與豬皮炎與腎病綜合征(PNDS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫等有關(guān)[3]。單獨的PCV2感染并不引起明顯的臨床癥狀，但當(dāng)與高致病性豬繁殖與呼吸綜合病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)等混合感染時，常造成嚴(yán)重的臨床癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[4-5]。

卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk，IgY)是一種從免疫禽類后禽蛋中提取的特異性抗體，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。兩條重鏈的分子量為60 ku～70 ku，輕鏈分子量為22 ku～30 ku[6]。蛋雞免疫后一個月內(nèi)可獲得的IgY抗體量是免疫兔子的18倍[7]，而且雞蛋存儲方便。研究顯示，雞蛋儲存在室溫或者4℃時，6個月內(nèi)，IgY效價無明顯下降[8]。此外，由于結(jié)構(gòu)上的差異，IgY不會激活哺乳動物的補體系統(tǒng)，也不與葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G和類風(fēng)濕因子等結(jié)合，這些特點使IgY在疾病診斷和治療方面有諸多優(yōu)點[9-11]。

本研究首先從河南省部分地區(qū)多個規(guī)?；B(yǎng)豬場采集疑似PCV2的病料樣品，對檢測為陽性的樣品進行PCV2全基因組測序及序列分析、病毒分離鑒定、制備滅活疫苗，并免疫蛋雞，制備PCV2高免IgY，為PCV2的防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與主要實驗材料 19份疑似PCV2的病料樣品為2017年～2018年采集自河南省南陽市、平頂山市、駐馬店市、周口市和安陽市的10個規(guī)?；B(yǎng)豬場，樣品類型包括肺臟、脾臟、淋巴和血清等。病毒DNA提取試劑盒、PCR Master Mix和pMD18-T載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；商品化PCV2滅活疫苗和IgY樣品分別購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司和山東綠葉制藥有限公司；PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒購自韓國金諾公司；羊抗鼠IgG-FITC購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PCV2單克隆抗體(MAb)由劉長明研究員惠贈；120日齡～150日齡海蘭褐蛋雞購自南陽市某規(guī)?；B(yǎng)雞場。

1.2 引 物 參考NCBI中PCV2 HN株(HM038021)基因序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計1對PCV2檢測引物和1對全長擴增引物。檢測引物序列為JC-PCV2-F：5'-CCCCAGGAGGGGGCTCAAACC-3'/JC-PCV2-R：5'-GCCTACGTGGTCTACATTCCC-3'；全長擴增引物為QC-PCV2-F：5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3'/QC-PCV2-R：AATACTTACAGCGCACTTCTTTCG。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

1.3 PCV2全基因組測序及分析 按常規(guī)方法處理組織和血液樣品提取DNA后，利用檢測引物進行PCR檢測。對檢測為PCV2陽性樣品的DNA利用全長擴增引物進行PCV2全基因組擴增，PCR產(chǎn)物由蘇州泓迅生物科技有限公司測序。利用DNAStar和MEGA6.0軟件對PCV2全基因組進行序列比對、同源性分析和遺傳進化樹構(gòu)建。

1.4 病毒分離 分別將PCV2陽性組織勻漿液和血清離心，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后分別接種于處于分裂期的PK-15細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入新鮮含有8%FBS的DMEM培養(yǎng)基和5 mmol/L D-氨基葡萄糖的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收取病毒液，凍融后繼續(xù)接種PK-15細(xì)胞系，按上述操作連續(xù)盲傳5代。對第5代細(xì)胞培養(yǎng)物進行總DNA提取、PCR檢測及病毒效價測定[9]。

1.5 滅活疫苗制備與蛋雞免疫 將效價為106.5TCID50/mL PCV2分離株(17HNA2)細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后離心取上清液，加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，37℃滅活36 h。然后將滅活病毒液與白油佐劑按2∶3比例混合，充分乳化，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

將30只120日齡～150日齡海蘭褐蛋雞隨機分為3組(A、B和C)，每組10只。A組免疫自制PCV2滅活疫苗，B組免疫商品化PCV2滅活疫苗，C組為陰性對照組。每組均采用胸部肌肉注射的方式免疫。首次免疫200 μL，之后分別在首免后第14 d和28 d再次免疫100 μL，第35 d加強免疫200 μL。收集整個免疫期間各組雞蛋并做好標(biāo)記，置4℃?zhèn)溆谩４送?，在首免后的?、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d分別采血，制備血清，置-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 不同方法制備IgY及其效價的測定 將首免后第0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d、63 d的雞蛋分別采用氯仿法[12]和水稀釋-硫酸銨沉淀法[13]制備IgY。前者取出蛋黃后，加入3倍體積的PBS，然后加入等體積氯仿萃取，之后吸取水相，加入PEG 6000至終濃度12%，將沉淀重懸后備用。后者取出蛋黃后，加入7倍蒸餾水，用稀鹽酸調(diào)pH至5.0～5.2，收集上清，此即卵黃水溶性成分(WSF)，即粗制IgY，最后再進行兩次硫酸銨沉淀。將兩種制備的IgY樣品分別通過SDSPAGE和PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測其純度。同時以商品化IgY作為陽性對照。

1.7 免疫雞血清IgG和蛋黃IgY ELISA抗體和中和抗體效價的檢測 將制備的各組雞免疫后不同時間的血清和IgY分別采用PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測各自的抗體水平。同時，將血清和IgY分別2倍倍比稀釋，然后取100 TCID50病毒液分別與等體積不同稀釋度的血清和IgY混合，37℃感作1 h。將病毒血清或者病毒IgY混合物接種96孔板培養(yǎng)48 h后的PK-15細(xì)胞，每孔100 μL(100 TCID50)。37℃培養(yǎng)5 d后，棄去板內(nèi)液體，洗滌后加入無水乙醇固定5 min～10 min后，以PCV2特異性MAb(1∶10)為一抗，以羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，熒光顯微鏡下觀察熒光，并根據(jù)Reed-Muench法計算血清和IgY的中和效價。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究ELISA抗體和中和抗體測定中，每組數(shù)據(jù)設(shè)立3個重復(fù)，每組實驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行Student氏t檢驗。其中，*：p<0.05；**：p<0.01。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品的檢測結(jié)果 對2017年～2018年采集自河南省的10個規(guī)?；B(yǎng)豬場19份疑似PCV2的陽性樣品進行PCR檢測。結(jié)果顯示，有12份樣品檢測結(jié)果為陽性，陽性率達(dá)63.2%，表明PCV2仍是河南地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)豬場的重要傳染原。

2.2 PCV2全基因組序列分析 對PCR檢測為陽性的12份PCV2樣品進行全基因組序列擴增并測序，并與PCV2參考株進行同源性和進化樹分析。結(jié)果顯示，本研究中12株P(guān)CV2之間的同源性為96.9%～100%，與參考株P(guān)CV2a CL(HM038033)、PCV2b 05-32650株(EF394779)、PCV2b HN株(HM038021)和PCV2dBDH株(HM038017)之間的同源性分別為95.1%～95.5%、95.4%～98.5%、95.5%～99.5%和95.5%～99.9%。進化樹分析結(jié)果顯示，12株P(guān)CV2中，8株(17HNA2、17HNA3、17HNA4、17HNA6、18HeNA8、18HeNA9、18HeNA11和18HeNA12)屬于PCV2d亞型，且形成兩個相對獨立的分支(圖1)。4株(17HNA1、17HNA5、18HeNA7和18HeNA10)屬于PCV2b亞型，與參考株P(guān)CV2b JF(HM038022)形成一個相對獨立的分支(圖1)。這些結(jié)果表明，PCV2d亞型是目前河南地區(qū)PCV2的主要流行株，且存在不斷變異的趨勢。

2.3 病毒分離 將12份PCV2陽性樣品常規(guī)處理后分別接種PK-15細(xì)胞，盲傳5代后經(jīng)PCR鑒定。結(jié)果顯示，7份樣品可以分離出病毒，分別命名為17HNA1、17HNA2、17HNA5、18HeNA7、18HeNA8、18HeNA9和18HeNA10。其中17HNA2分離株效價為106.5TCID50/mL最高，其它分離株效價為102.0TCID50/mL～104.5TCID50/mL。

2.4 IgY不同制備方法比較 將免疫后28 d收集的雞蛋分別經(jīng)氯仿法和水稀釋-硫酸銨沉淀法制備IgY樣品后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果顯示，所有IgY樣品均有兩條目的條帶(重鏈和輕鏈)，大小分別為67 ku和23 ku(圖2)。其中氯仿法制備的IgY樣品兩條目的條帶較為清晰，且雜蛋白較少。水稀釋-硫酸銨沉淀法制備的WSF樣品雜蛋白較多。一次硫酸銨沉淀后雜蛋白明顯減少，但目的蛋白仍不清晰。二次硫酸銨沉淀后，目的蛋白得到濃縮，純度進一步提高，結(jié)果較為理想。

圖1 PCV2分離株與參考株的遺傳進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree based on the newly emerged PCV2 isolates and reference strains

圖2 不同方法制備IgY效果的檢測結(jié)果Fig.2 Analysis of IgY samples with different preparation methods by SDS-PAGE

將各組免疫后0 d蛋樣混合物和免疫后28 d的蛋樣混合物，分別通過上述兩種方法制備IgY，并經(jīng)PCV2 ELISA抗體檢測。結(jié)果顯示，前者蛋樣中，氯仿法制備的IgY樣品OD450nm值顯著低于水稀釋-硫酸銨沉淀法(p<0.01)，表明氯仿法制備的IgY純度較高，特異性較強。而免疫后28 d蛋樣中兩種方法制備的IgY OD450nm值差異不顯著(p>0.05)(圖3)，表明兩種方法制備的IgY均具有較好的活性，能夠與PCV2抗原發(fā)生特異性結(jié)合。

圖3 ELISA比較不同方法制備的IgY效果Fig.3 Analysis of IgY samples with different preparation methods by ELISA

2.5 免疫雞血清IgG和蛋黃IgY ELISA抗體和中和抗體效價的檢測結(jié)果 分別測定不同組蛋雞在免疫后不同時間點的血清IgG和蛋黃IgY的ELISA抗體和中和抗體水平。結(jié)果顯示，在首免后7 d，A組和B組雞ELISA抗體水平快速上升，28 d達(dá)到峰值，此后一直持續(xù)至實驗結(jié)束(首免后63 d)。兩組之間均無顯著差異(p>0.05)；兩組雞的中和抗體水平也是在首免后7 d快速上升，28 d達(dá)到峰值，最高中和抗體效價達(dá)1∶181。兩組之間也無顯著差異(p>0.05)，對照C組雞兩種抗體在整個實驗期間均未檢測到(圖4)。表明自制PCV2滅活疫苗和商品化PCV2滅活疫苗均可誘導(dǎo)蛋雞產(chǎn)生較高水平的特異性IgY。

3 討論

PCV2感染會造成豬生長緩慢，料肉比下降，養(yǎng)殖成本增加，而且其還破壞豬體免疫系統(tǒng)，繼發(fā)其它病原感染，給養(yǎng)殖業(yè)重大損失[14]。此外，近年來，PCV2變異株不斷出現(xiàn)，給該病的防控帶來了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。我國PCV2流行株包括PCV2a、PCV2b和PCV2d，其中以PCV2b為主。但是近年監(jiān)測顯示，PCV2d有逐步替代PCV2b，成為流行株的趨勢[15]。本研究報道12株P(guān)CV2中，PCV2d亞型8株，占66.7%，也符合這一趨勢。

圖4 ELISA方法(A)和中和試驗方法(B)檢測不同免疫組雞血清IgG和蛋黃IgY抗體的結(jié)果Fig.4 Changes of IgG in sera and IgY in egg yolk in different groups detected by ELISA(A)and neutralization test(B),respectively

目前，PCV2引起的疫病的防控主要依靠疫苗免疫。但由于病毒變異、疫苗質(zhì)量差以及免疫程序不合理等因素，常造成免疫失敗。而且，現(xiàn)階段對PCV2感染的治療也沒有特效藥，對病豬的治療主要集中在防止繼發(fā)感染、提高機體抵抗力等方面。本研究研制的抗PCV2特異性IgY，不僅可以用于PCV2的預(yù)防，也可用于感染后的緊急治療，給該病的防治帶來了新思路。

本研究采用兩種方法制備的IgY，效果均較為理想。但由于氯仿具有高毒性，且用量大、價格高，產(chǎn)物中有氯仿殘留等缺點，因此該方法不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)，其制備的抗體也不能用于臨床治療。但該方法制備效果好，省時省力，短時間內(nèi)即可獲得高質(zhì)量的IgY抗體，適合用于抗體效價檢測等。相對而言，水稀釋-硫酸銨沉淀法不含毒性物質(zhì)，不會造成環(huán)境污染，且成本較低，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。

PCV2細(xì)胞培養(yǎng)的病毒效價偏低一直是行業(yè)難題。本研究分離出一株效價達(dá)106.5TCID50/mL的PCV2。且用該株病毒制備的PCV2滅活疫苗與商品化PCV2滅活疫苗免疫蛋雞后均能誘導(dǎo)其產(chǎn)生較高水平的IgY，且該IgY具有較高水平的中和效價(1∶181)，為進一步降低PCV2 IgY生產(chǎn)成本，提升其工業(yè)化生產(chǎn)能力奠定了堅實的基礎(chǔ)。

本研究通過PCV2分離鑒定、制備PCV2滅活疫苗及免疫產(chǎn)蛋雞，獲得了較高效價的IgY，且抗體產(chǎn)生穩(wěn)定，持續(xù)時間長。通過水稀釋-硫酸銨沉淀法制備的IgY具有純度高，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)的特點。本研究為進一步開展IgY抗PCV2研究奠定了基礎(chǔ)。