金霉素對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理及細(xì)菌多樣性的影響

陳峻峰，顏智勇，邵繼海，舒 鵬，王 杰，文樹龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

畜禽養(yǎng)殖廢水是一種具有高COD、高氨氮、高SS且難處理的廢水［1，2］。四環(huán)素類抗生素是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)常用的抗生素之一，具有較強(qiáng)的抗菌效應(yīng)。金霉素是一種典型的四環(huán)素類生物抑制藥物，對(duì)廢水生物處理過(guò)程中的大多數(shù)微生物有明顯的抑制作用，含金霉素的畜禽養(yǎng)殖廢水的生物處理效果較差［3］。厭氧處理工藝是利用厭氧微生物在無(wú)氧情況下通過(guò)自身代謝過(guò)程將廢水中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)物和少量細(xì)胞物質(zhì)的過(guò)程［4］。厭氧生物處理技術(shù)可用來(lái)處理難降解有機(jī)廢水也可以提高廢水可生化性［5］。

目前研究者對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水金霉素對(duì)厭氧微生物的影響機(jī)理尚不清楚，不過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為深入研究環(huán)境系統(tǒng)中的微生物提供了先進(jìn)的技術(shù)手段［6］。已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境微生物的研究［7，8］，但是鮮有利用分子生物學(xué)技術(shù)針對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中金霉素對(duì)厭氧微生物群落的影響報(bào)道。

通過(guò)從受金霉素影響的厭氧顆?；钚晕勰嘀刑崛】侱NA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-梯度變形凝膠電泳(DGGE)、割膠回收再做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、克隆后測(cè)序以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等新的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)受金霉素影響的厭氧活性污泥中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，獲得厭氧顆粒污泥中細(xì)菌組成和功能以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，從而為進(jìn)一步更好處理畜禽養(yǎng)殖廢水提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厭氧處理工藝及取樣

試驗(yàn)用金霉素購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。試驗(yàn)用顆粒污泥取自長(zhǎng)沙市某畜禽養(yǎng)殖廢水處理廠的UASB反應(yīng)器，在實(shí)驗(yàn)室(35±2)℃穩(wěn)定培養(yǎng) 48 h，污泥濃度為 40.75 g/L。

試驗(yàn)裝置如圖1所示。反應(yīng)瓶容積為500 mL，瓶口用橡膠塞密封，橡膠塞上設(shè)置導(dǎo)管，將產(chǎn)生的氣體引入3%NaOH溶液，以吸收氣體中的CO2，排出的液體即為甲烷產(chǎn)量。向反應(yīng)瓶中加入100 mL活性顆粒污泥、400 mL配水，一定量的金霉素并且搖勻，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，以此探明金霉素對(duì)養(yǎng)殖廢水厭氧消化的抑制作用。根據(jù)金霉素對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)廢水厭氧消化抑制作用的研究［9］，設(shè)置金霉素的濃度分別為 0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/L，編號(hào)分別 1、2、3、4、5進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照瓶中不添加金霉素，其他條件與受試瓶相同。各反應(yīng)瓶均做平行試驗(yàn)。將反應(yīng)瓶置于恒溫振蕩水浴鍋中，定時(shí)搖動(dòng)以保證污泥處于懸浮狀態(tài)［10］。每天定時(shí)測(cè)定產(chǎn)甲烷量，直至基本停止產(chǎn)氣。每天測(cè)定COD濃度，反應(yīng)結(jié)束后取活性污泥于－20℃保存。

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 Experimental Apparatus

1.2 活性污泥總DNA提取

百泰克試劑盒法:采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，具體試驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書，提取完成后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 PCR 擴(kuò)增

采用上海生工合成的細(xì)菌16S rDNA通用引物341F(5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)［11-15］和517R(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)［15-17］直接對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中在341F的5’末端加40 bp的 GC夾(5’-CGC CCG CCG GGC CCC GGG CCC GGC CCG CCC CCG CCC G-3’)［12-15］，用于后續(xù)的DGGE。PCR擴(kuò)增體系為Easy Taq DNA Polymeerase(TransGen，北京)1 μL(5 U)，10 × Easy Taq Buffer 5 μL(200 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L KCl、100 mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/L MgSO4)，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL(0.2 mmol/L)，引物為1 μL(20 μmol/L)，模板 DNA 為1 μL，其余用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL體系。PCR反應(yīng)在上擴(kuò)增，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃預(yù)變性30 s;65℃退火1 min;72℃延伸1 min，循環(huán)33次;72℃延伸7 min;4℃保溫。PCR反應(yīng)后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 DGGE 分析

將上面步驟得到的PCR產(chǎn)物在DCode System(Bio-Rad，USA)上進(jìn)行電泳，變性濃度范圍為45% ～65%，聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%，電壓設(shè)置為70 V，電泳時(shí)間為16 h，溫度設(shè)定為60℃。電泳結(jié)束后，凝膠電泳以0.5 μg/mL的溴化乙錠溶液染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

為了了解菌種在受金霉素影響的反應(yīng)器中的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)DGGE條帶圖譜進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，重點(diǎn)對(duì)細(xì)菌種群的豐富度和相關(guān)性進(jìn)行分析。豐富度分析以圖譜中所有的條帶數(shù)為1，不同樣品的細(xì)菌種群豐富度為該樣品的條帶數(shù)除以圖譜中的總條帶數(shù)(同一位置的條帶只能算一條)，具體公式如下。

式中，Rsi為第i泳道的細(xì)菌種群豐富度值;

Li為第i條泳道上的條帶數(shù);

Lt為圖譜中的總條帶數(shù)。

相關(guān)性分析主要分析不同樣品之間細(xì)菌種群的相似性，兩條帶之間的相似系數(shù)可以用Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)(Cs)公式［18，19］計(jì)算。

式中，CSAB為泳道A和泳道B之間的相似性系數(shù);

LAB為泳道A上的與泳道B上位置相同的條帶數(shù);

LA為泳道A上的條帶數(shù);

LB為泳道B上的條帶數(shù)。

1.6 切膠PCR、克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析

在紫外燈下切下DGGE條帶，切下后放入干凈離心管，然后用膠回收試劑盒做膠回收，再對(duì)回收的DNA用不含GC夾的341F和517R進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上，得到的PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。將得到的PCR產(chǎn)物用pEASY-T1 Cloning Kit(TransGen，北京)進(jìn)行克隆，最后對(duì)挑選的克隆子送交測(cè)序公司(Sangon，上海)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI獲得接受號(hào)。使用 NCBI的 GenBank的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建NJ樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行情況

厭氧反應(yīng)器馴化結(jié)束后，投加不同量的金霉素，連續(xù)運(yùn)行7 d，每天監(jiān)測(cè)運(yùn)行參數(shù)(包括pH、COD和產(chǎn)甲烷量)，第8 d后產(chǎn)甲烷體積忽略不計(jì)且COD的變化也甚微。具體結(jié)果如圖2、圖3所示，圖2縱坐標(biāo)為產(chǎn)甲烷體積以10為底的對(duì)數(shù)，圖3縱坐標(biāo)為COD的濃度以10為底的對(duì)數(shù)。

圖2 金霉素對(duì)禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理系統(tǒng)甲烷產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of Chlortetracycline on Methane Yield in Livestock Wastewater in Anaerobic Biological Treatment System

圖3 禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理系統(tǒng)中COD濃度的變化情況Fig.3 Changes of COD Concentration in Anaerobic Biological Treatment System

由圖2可知在系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的前5 d對(duì)照組的產(chǎn)甲烷量明顯高于試驗(yàn)組，計(jì)算得 1、2、3、4、5、6 組的CH4的 總 產(chǎn) 量 分 別 是 242、232、220、196、184、260 mL，試驗(yàn)組與對(duì)照組的差值率分別是6.9%、10.8%、15.4%、24.6%、29.2%，說(shuō)明金霉素對(duì)厭氧微生物產(chǎn)甲烷的能力起到抑制作用;隨著金霉素濃度的增加，其抑制作用依次增大，兩者成正比例關(guān)系。到第6 d時(shí)所有的試驗(yàn)瓶基本停止產(chǎn)氣。由圖3可知COD在第1、2 d時(shí)降解速度最快，第3 d后平穩(wěn)降解，對(duì)照組COD的濃度明顯低于金霉素的試驗(yàn)組，試驗(yàn)組的COD去除率分別是90.89%、89.02%、88.93%、87.95%、86.96%，對(duì)照組的 COD 去除率達(dá)到94.46%，這說(shuō)明金霉素對(duì)厭氧微生物處理COD的能力起到抑制作用。隨著金霉素濃度的增加，其抑制作用依次增大，兩者是正比例關(guān)系，與其對(duì)產(chǎn)甲烷能力的趨勢(shì)是一致的。

2.2 DNA提取以及PCR擴(kuò)增

提取的污泥微生物DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明初提的微生物總DNA片段長(zhǎng)度正常，且獲得了較高的量(如圖4a)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖電泳后以溴化乙錠(EB)溶液染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照，由圖4b可知PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為250 bp左右。

圖4 DNA提取和PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的瓊脂糖電泳圖Fig.4 Map of DNA and PCR Products after Agarose Gel Electrophoresis

2.3 DGGE圖譜的細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)分析

在Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)下，使用Quantity One V4.52(Bio-Rad，USA)軟件對(duì)經(jīng)溴化乙錠(0.5 μg/mL)染色的DGGE凝膠進(jìn)行成像，在6條泳道上一共觀察到23條不同的條帶如圖5a所示;圖5b是根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)的成像照片，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)軟件分析后的DGGE圖譜示意圖，各條帶的豐富度值、分布及相關(guān)性分析的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1、表2所示。

由圖5、表1可知在1～5泳道中出現(xiàn)的條帶都可以在第6泳道中找到，金霉素處理組的條帶數(shù)均小于對(duì)照;而且從第1泳道到第5泳道的Rs值開(kāi)始變小，這說(shuō)明隨著金霉素濃度的增加，對(duì)細(xì)菌群落的影響在變大，細(xì)菌群落數(shù)量在減少。由表2可知從第1泳道到第5泳道依次與第6泳道的對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn)隨著金霉素濃度的增加，其與對(duì)照組的相似性系數(shù)在減小，同樣可以說(shuō)明金霉素對(duì)微生物群落產(chǎn)生了抑制作用。

表1 細(xì)菌群落豐富度值Tab.1 Richness Value of Bacterial Community

表2 各組細(xì)菌種群相似性系數(shù)Tab.2 Comparability Index of Bacterial Population in Different Groups

圖5 DGGE凝膠成像圖及DGGE圖譜示意圖Fig.5 Gel Imaging and Analysis Map of DGGE

2.4 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

由于23條帶亮度不同，選取典型且亮度很高的差異性條帶進(jìn)行切膠回收、PCR重?cái)U(kuò)增、克隆后測(cè)序，獲得圖5a中 A、B、C、D、E 中不同的 16S rDNA序列，提交給GenBank注冊(cè)，獲得臨時(shí)登錄號(hào)，條帶與臨時(shí)登錄號(hào)之間對(duì)應(yīng)關(guān)系如表3所示。使用GenBank的BLAST程序，將獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得各序列的同源性信息(表3)，然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建NJ樹，如圖6所示。

表3 序列的BLAST結(jié)果Tab.3 Results of Sequences using BLAST

圖6 根據(jù)序列和BLAST建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic Trees of Bacterial Based on Results of BLAST of Sequences

由表3、圖6可知 C與Burkholderia cenocepacia的親緣關(guān)系比較接近，而C在1、2、3、4、對(duì)照組中的條帶比較弱，這與Chopra等［20］研究發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗生素促使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性是一致的;A與Nitrosomonas eutropha的親緣關(guān)系比較接近，是硝化過(guò)程中一類常見(jiàn)的自養(yǎng)菌，它可以從氧化氨氮的過(guò)程中獲得能量而生長(zhǎng)繁殖，A在6組中均有此類，這與Purkhold等［21］在研究金霉素影響氨氧化細(xì)菌多樣性的調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)了此菌種;B、C、E在BLAST比對(duì)與Uncultured bacterium的親緣性比較接近，是一類不能純培養(yǎng)的細(xì)菌，此類的細(xì)菌與Burkholderia cenocepacia和Nitrosomonas eutropha也存在一定的親緣關(guān)系，說(shuō)明此類細(xì)菌在金霉素的影響下產(chǎn)生耐藥性，組成了整個(gè)厭氧活性污泥細(xì)菌多樣性，且對(duì)于廢水的除碳氮有著一定的作用。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的連續(xù)監(jiān)測(cè)，受到金霉素影響的試驗(yàn)組會(huì)比對(duì)照組的COD濃度要高，產(chǎn)甲烷量要小，而且是隨著金霉素濃度的增加，產(chǎn)甲烷量差值從6.9%擴(kuò)大到29.2%，COD去除率從90.89%降至86.96%，而對(duì)照組COD去除率達(dá)到94.46%。

(2)通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)對(duì)厭氧活性污泥中細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)的分析，發(fā)現(xiàn)隨著金霉素濃度的增加，厭氧活性污泥中的細(xì)菌種群豐富度Rs從0.913到0.652;對(duì)各組的系數(shù)比較也可以看出隨著金霉素濃度的增加，其與對(duì)照組的差距也在增大，相似性系數(shù) CS從97.6 到 78.9。

(3)PCER-DGGE技術(shù)對(duì)于監(jiān)測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)合DNA測(cè)序、序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育性分析對(duì)厭氧活性污泥中微生物做出種屬鑒定［6］，可為研究畜禽養(yǎng)殖廢水中金霉素處理機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

［1］段妮娜，董濱，何群彪，等.規(guī)模化養(yǎng)豬廢水處理模式現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)［J］.凈水技術(shù)，2008，27(4):9-15，37.

［2］顏智勇，吳根義，劉宇賾，等.UASB/SBR/化學(xué)混凝工藝處理養(yǎng)豬廢水［J］.中國(guó)給水排水，2007，23(14):66-68.

［3］孫建平，鄭平，胡寶蘭.金霉素對(duì)豬場(chǎng)廢水厭氧消化抑制作用［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，42(4):652-655

［4］王寶貞.水污染治理新技術(shù)、新工藝、新概念、新理論［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［5］Speece R E.李亞新譯.工業(yè)廢水的厭氧生物技術(shù)［M］.北京:中國(guó)建筑工業(yè)出版社，2001.

［6］肖勇，楊朝暉，曾光明，等.PCR-DGGE研究處理垃圾滲濾液序批式生物膜反應(yīng)器(SBBR)中的細(xì)菌多樣性［J］.環(huán)境科學(xué)，2007，28(5):1095-1101.

［7］Kawai M，Matsutera E，Kanda H，et al.16S ribosomal DNA-based analysis of bacterial diversity in purified water used in pharmaceutical manufacturing processes by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis ［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2002，68(2):699-704.

［8］蘇俊峰，馬放，王弘宇，等.利用 PCR-DGGE技術(shù)分析生物陶粒硝化反應(yīng)器中微生物群落動(dòng)態(tài)［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(3):386-390.

［9］孫建平.抗生素與重金屬對(duì)豬場(chǎng)廢水厭氧消化的抑制效應(yīng)及其調(diào)控對(duì)策［D］.杭州:浙江大學(xué)，2009.

［10］朱曉磊，王路光，王靖飛，等.土霉素對(duì)厭氧生物處理的抑制作用研究［J］.中國(guó)給水排水，2010，26(1):93-95.

［11］Yoshida N，Yagi K，Sato D，et al.Bacterial communities inpetroleum oil in stockpiles［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，99(2):143-149.

［12］Ishii K，F(xiàn)ukui M.Opt imization of annealing temperature to reducebias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(8):3753-3755.

［13］Veeh R H，Sumithraratne P.Monitoring of microbial souring in chemically treated，produced-water biofilm systems using molecular techniques［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2005，32(4):163-170.

［14］Ferris M J，Muyzer G，Ward D M.Denaturant gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial community［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(1):340-346.

［15］Muyzer G，Brinkhoff T，Ulrich N，et al.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)in microbialecology［J］.Molecular Microbial Ecology Manual，1998，34(4):1-27.

［16］Suzuki K，Koyanagi M，Yamashita H.Genetic characterization and specific detect ion of beer-spoilage Lactobacillus sp.LA2 and related strains［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(4):677-683.

［17］Hashizume T，Takai C，Naito M，et al.Characteristics of the mucus layer on the surface of the bluegill(Lepomis macrochirus)and the bacterial flora in the mucus［J］.Microbes and Environments，2005，20(1):69-80.

［18］Gillian D C，Speksnijder A G C L，Zwart G，et al.Genetic diversity of the biofilm covering Montacuta ferruginosa(Mollusca，Bivalvia)as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and cloning of PCR amplified gene fragment coding for 16SrDNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(9):3464-3472.

［19］Murray A E，Hollibaugh J T，Orrego C.Phylogenetic composition of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(7):2676-2680.

［20］Ian Chopra，Marilyn Roberts.Tetracycline Antibiotics:Mode of Action，Applications，Molecular Biology，and Epidemiology of Bacterial Resistance［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65(2):232-260.

［21］Purkhold U，Pommerening-R?ser A， Juretschko S， et al.Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amoA sequence analysis:implications for molecular diversity surveys［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(12):5368-5382.