黑荊樹不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)與芽分化的研究

唐佳佳，尚旭嵐，洑香香

（南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

黑荊樹不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)與芽分化的研究

唐佳佳，尚旭嵐，洑香香*

（南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

為建立高效的黑荊樹快速繁殖體系，以黑荊樹葉片、莖段和下胚軸為外植體，在添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化研究。結(jié)果表明：綜合最高誘導(dǎo)率結(jié)果和愈傷組織的生長狀況，外植體的愈傷組織誘導(dǎo)能力順序為葉片（44.83%）＞下胚軸（36.35%）＞莖段（30.05%）；愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg／L 6-BA＋0.005 mg／L TDZ＋1.0 mg／L IBA。葉片和下胚軸所誘導(dǎo)的愈傷組織均可分化出不定芽，但芽誘導(dǎo)率差異達(dá)極顯著水平；不定芽分化最佳培養(yǎng)基為MS＋0.01 mg／L TDZ＋0.2 mg／L IBA，葉片愈傷組織的芽分化率最高可達(dá)32.60%。

黑荊樹；外植體；愈傷組織；誘導(dǎo)；芽分化

黑荊樹（Acacia mearnsii De Wild）樹皮含單寧達(dá)40%，是當(dāng)今世界上主要的鞣質(zhì)樹種之一，也是生產(chǎn)薪炭材、包裝紙用紙漿材的上好樹種。黑荊樹樹皮中富含原花色素，原花色素是迄今發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的幾種能夠防止大腦和神經(jīng)組織氧化的抗氧化劑之一［1］。此外，黑荊樹對控制水土流失、改良土壤都起著重要的作用，是重要的經(jīng)濟和生態(tài)樹種［2］。黑荊樹雖然易于用種子繁殖，但組織培養(yǎng)技術(shù)可以加速優(yōu)良無性系的快速繁殖和推廣。自黑荊樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究開展以來，黑荊樹組織培養(yǎng)條件和建立植株再生體系的影響因素依然是學(xué)者一直在研究的重要課題［3－7］。建立高頻再生體系需要誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織的誘導(dǎo)是實現(xiàn)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和建立高產(chǎn)細(xì)胞系的前提和基礎(chǔ)［8］。

外植體的選擇是愈傷組織誘導(dǎo)和建立再生體系的第一環(huán)節(jié)。外植體可以選擇為莖尖、胚、胚軸、子葉、幼芽、嫩葉和幼根等。關(guān)于黑荊樹愈傷組織的培養(yǎng)已有報道［4－6］，但從愈傷組織上分化出不定芽，至今還未見報道。本試驗選擇黑荊樹的葉片、莖段和下胚軸3種外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與分化，探討外植體種類、植物生長調(diào)節(jié)劑組合對黑荊樹愈傷組織培養(yǎng)的影響，為進(jìn)一步建立組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

黑荊樹種子由云南楚雄種子園提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體的準(zhǔn)備與處理

（1）葉片和莖段外植體：用100℃開水處理種子20 min后，換清水浸泡24 h，挑選吸脹的種子播在等體積珍珠巖和草炭的基質(zhì)中，待苗高達(dá)到約15 cm時即可取葉片和莖段作為外植體。流水輕輕沖洗外植體表面臟物后，用洗潔精溶液浸泡振蕩3 min，流水沖洗1 h；瀝干水后，置于超凈工作臺上，用70%酒精消毒20 s，0.1%HgCl2消毒8 min，再用無菌水清洗4～5次。將消毒好的葉片切成0.5 cm× 1.0 cm的小塊，將莖段切成0.5～1.0 cm的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

（2）下胚軸外植體：用100℃開水處理種子20 min后，換清水浸泡24 h，挑選吸脹的種子在70%酒精中消毒1 min，0.1%HgCl2消毒15 min，再用無菌水漂洗4～5次后接種在MS培養(yǎng)基上。10 d左右取無菌苗下胚軸，切成長約5 mm的小段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)：將處理后的外植體材料接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，添加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，TDZ和IBA，組成3因素3水平正交試驗設(shè)計（見表1）。每個處理接種8瓶，每瓶3個相同外植體，試驗重復(fù)3次。接種后定期觀察，培養(yǎng)期間及時剔除污染的培養(yǎng)瓶，以免交叉污染。30 d后統(tǒng)計各處理的接種數(shù)（除去污染數(shù)目）、愈傷率，比較愈傷組織的長勢，篩選最適宜愈傷組織誘導(dǎo)的外植體和最佳分化培養(yǎng)基。

愈傷組織分化培養(yǎng)：將各外植體誘導(dǎo)得到的愈傷組織切成大小相近的小塊，轉(zhuǎn)接到MS分化培養(yǎng)基中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ和IBA（見表1）。在分化過程中定期觀察、統(tǒng)計。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度為6 g／L，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g／L，pH值5.8。除愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)需在外植體接種后暗培養(yǎng)24 h外，其余均在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度（24± 2）℃，光照強度為50 μmol／（m2·s），光照時間為12 h／d。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度 mg／L

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析 培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計各個處理的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。愈傷組織誘導(dǎo)率＝（出現(xiàn)愈傷組織的葉片數(shù)／接種后未污染葉片數(shù)）×100%；不定芽分化率＝（分化不定芽愈傷組織塊數(shù)／接種愈傷組織塊數(shù)）×100%。利用專業(yè)統(tǒng)計軟件DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑荊樹愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 最佳外植體的篩選 3種外植體，在加入不同質(zhì)量濃度的生長素和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。觀察發(fā)現(xiàn)，接種10 d左右，葉片明顯增厚，呈卷曲狀，莖段和下胚軸膨大增粗；15 d左右，3種外植體均從傷口處陸續(xù)長出淡綠色愈傷組織。

不同外植體在不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率有很大差別（見表2）。葉片的誘導(dǎo)率范圍為10.29%～44.83%，下胚軸的誘導(dǎo)率范圍為12.09%～36.35%，莖段的誘導(dǎo)率范圍為11.98%～30.04%。比較不同外植體獲得的最高誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)葉片的誘導(dǎo)率最高，下胚軸次之，莖段最差。方差分析表明，不同外植體的誘導(dǎo)率差異顯著；從愈傷組織的類型和質(zhì)地來看，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織中綠色、有光澤、質(zhì)地致密的愈傷組織量較多（見圖1-1），下胚軸愈傷組織中淡黃色、質(zhì)地松軟的愈傷組織量中等（見圖1-2），莖段愈傷組織中淡黃綠色、質(zhì)地松軟的愈傷組織量較少（見圖1-3）；從愈傷組織出現(xiàn)的時間來看，下胚軸需13 d左右，葉片需15 d左右，莖段需18 d左右。對愈傷出現(xiàn)的時間、誘導(dǎo)率、愈傷組織類型及取材難易程度綜合分析，認(rèn)為葉片是黑荊樹誘導(dǎo)愈傷組織最適合的外植體。

表2 不同外植體在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率比較

2.1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響愈傷組織的誘導(dǎo)不僅要考慮誘導(dǎo)率和愈傷組織的數(shù)量，而且要重視愈傷組織的質(zhì)量（不定芽的分化）。方差分析表明，同一外植體在不同培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率差異均達(dá)極顯著水平，說明不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)率有極顯著影響。對誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量、顏色和質(zhì)地進(jìn)行觀測發(fā)現(xiàn)，3種外植體在7號培養(yǎng)基上不僅誘導(dǎo)率高，而且愈傷組織產(chǎn)量高，質(zhì)量較好，利于繼續(xù)培養(yǎng)。

對葉片和下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析（見表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDZ對葉片和下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響均極顯著；IBA對葉片和下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別呈極顯著和顯著；6-BA對葉片和下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別呈顯著和不顯著。從影響程度來看，影響最大的是TDZ，其次是IBA，6-BA的影響最小。綜合考慮愈傷組織誘導(dǎo)率和生長狀況，適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg／L 6-BA＋0.005 mg／L TDZ＋1.0 mg／L IBA，在其上葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)45%左右。

2.2 不定芽的誘導(dǎo)

將各外植體誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，當(dāng)愈傷組織長度大于0.5～1.0 cm時，接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，外植體中只有葉片（見圖1-4、1-5）和下胚軸（見圖1-6）的愈傷組織可以分化不定芽，莖段的愈傷組織不能分化不定芽。其中葉片愈傷組織在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的芽誘導(dǎo)率范圍為13.03%～32.60%，下胚軸的芽誘導(dǎo)率范圍為4.79%～14.33%（見表3）。總體來看，不管在何培養(yǎng)基上，葉片愈傷組織的芽誘導(dǎo)率都高于下胚軸，分化率存在極顯著差異。根據(jù)不定芽的最高誘導(dǎo)率進(jìn)行篩選，認(rèn)為培養(yǎng)基MS＋0.01 mg／L TDZ＋0.2 mg／L IBA上，不定芽分化率高，且生長良好。

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對黑荊樹愈傷組織分化的影響

方差分析表明（見表4），TDZ對葉片和下胚軸不定芽分化都呈極顯著差異，起著主要作用；IBA和2種激素類物質(zhì)的交互作用，對葉片愈傷組織的芽分化的影響，分別呈現(xiàn)顯著和極顯著差異，而對下胚軸愈傷組織的芽分化影響不顯著。

表4 TDZ與IBA不同質(zhì)量濃度組合培養(yǎng)基中不定芽分化率方差分析

3 結(jié)論與討論

圖1 不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和芽分化情況

植物愈傷組織的誘導(dǎo)主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境3大因素的調(diào)控［9－11］。不同植物的器官和組織，其形態(tài)發(fā)生能力各不相同；即使同種植物不同部位外植體，所需要的營養(yǎng)和植物激素的用量也不相同。誘導(dǎo)效果差異的原因可能是由于它們的生理狀態(tài)和所處的生育時期不同，其內(nèi)源激素濃度和比例不同［12－13］。本研究中，3種外植體產(chǎn)生愈傷組織的能力不同，葉片比下胚軸、莖段愈傷組織誘導(dǎo)能力強，且其愈傷組織的芽分化能力也強。表現(xiàn)在葉片出愈時間早、誘導(dǎo)率高、產(chǎn)生的愈傷組織量多且質(zhì)量好、不定芽分化率高等，這與許多植物的表現(xiàn)一致［8］。

外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，對激素種類和質(zhì)量濃度的反應(yīng)差別甚大。本試驗利用TDZ、6-BA與IBA協(xié)同作用誘導(dǎo)愈傷組織，TDZ誘導(dǎo)葉片和下胚軸愈傷組織的作用極顯著，影響大于6-BA，這可能與外植體本身所含的內(nèi)源激素的種類、濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)［14］。在組織培養(yǎng)中，添加TDZ有利于愈傷組織的誘導(dǎo)增殖，且與6-BA有很好的協(xié)同作用［15］。

另外，TDZ對外植體芽的再生誘導(dǎo)效果好［16－19］，許多難以離體分化的植物因采用TDZ而達(dá)到高頻分化［9］。吳雪梅等［20］在草莓葉片和楊海蕓等［21］在蝴蝶蘭葉片的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，TDZ比6-BA能更好地誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，筆者在本試驗中也得出相同的結(jié)論。分析可能由于TDZ具有極強的細(xì)胞分裂素活性，細(xì)胞可以能長時間保持較高的分化能力［22］，且TDZ具有一定的作用范圍，在最適宜的含量范圍內(nèi)，其對不定芽的誘導(dǎo)作用最明顯，含量過低效果不明顯，含量過高對不定芽的生長有毒害作用，產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象［23］。本研究中0.01 mg／L TDZ有利于葉片和下胚軸愈傷組織不定芽的分化，質(zhì)量濃度過高或過低不定芽分化率明顯降低，分析可能是TDZ質(zhì)量濃度過高或過低導(dǎo)致細(xì)胞分裂素與生長素失衡。另外，TDZ在0.01 mg／L下，隨著IBA質(zhì)量濃度的增加，不定芽的分化率呈極顯著差異，分析可能是外源性激素IBA抑制了TDZ誘導(dǎo)內(nèi)源性生長素積累，從而一定程度上抑制了外植體的不定芽發(fā)生［24］。所以愈傷組織不定芽的分化不僅與外源激素的質(zhì)量濃度有關(guān)，還和外源激素間的比值有關(guān)。

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Callus induction and differentiation with diverse explants of Acacia mearnsii

TANG Jia-jia，SHANG Xu-lan，F(xiàn)U Xiang-xiang*
（College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

To establish an efficient tissue culture system for rapid propagation of Acacia mearnsii，the leaves，stem segments and hypocotyls were used as explants and cultured on MS medium.And effects of different types and concentrations of plant growth regulators on the induction and differentiation of callus were examined.The results showed that for the induction rate and the growth of callus，leaves were the best of three explants with the suitable medium of MS＋1.5 mg／L 6-BA＋0.005 mg／L TDZ＋1.0 mg／L IBA.The callus of leaves and hypocotyls could induce adventitious buds.Moreover，different explants had a significant effect on differentiation rate.As for the adventitious buds differentiated from leaves’callus，the best differentiation value up to 32.60%was gained on medium of MS＋0.01 mg／L TDZ＋0.2 mg／L IBA.

Acacia mearnsii；Explant；Callus；Induction；Bud differentiation

Q813.1.3

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.02.002

1001－7380（2014）02－0006－05

2014-02-20；

2014-02-26

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201104019）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PADA）；江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目

唐佳佳（1990－），女，安徽安慶市人，碩士研究生，主要從事林木種苗科學(xué)與技術(shù)研究。E-mail：tang900622＠163.com。

*通信作者：洑香香（1969－），女，江蘇南京市人，教授，研究方向：森林培育。E-mail：xxfu＠njfu.edu.cn。