轉化生長因子β1及其受體與高碘促成纖維細胞增殖作用的相關性研究

華淺近，祖茂衡，胡琳，莊銀蘋

·實驗研究Experimental research·

轉化生長因子β1及其受體與高碘促成纖維細胞增殖作用的相關性研究

華淺近，祖茂衡，胡琳，莊銀蘋

目的研究轉化生長因子β1（TGF-β1）及其受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）與高碘促成纖維細胞增殖作用的相關性，探索布-加綜合征（BCS）隔膜組織形成機制。方法實驗分為5組，空白對照組、溶媒組、KI組、TGF-βRⅠ抑制劑（SD-208）組和SD-208和碘化鉀（KI）共同作用組。采用CCK-8法檢測TGF-βRⅠ抑制劑對高碘培養(yǎng)環(huán)境中成纖維細胞增殖率的影響；采用免疫印跡法檢測不同濃度（0、250、500、1 000、2 000、3 000μg/L）碘離子對成纖維細胞TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達的影響。結果①在1 000μg/L碘培養(yǎng)環(huán)境中，KI與SD-208共同作用組成纖維細胞增殖率（1.29±0.41）高于SD-208組（0.52±0.10），而低于KI組（1.70±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。②1 000μg/L和2 000μg/L高碘組成纖維細胞TGF-β1蛋白相對表達量高于其他各組（P＜0.05）。各組間成纖維細胞TGF-βRⅠ蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論①高碘因素可能通過提高成纖維細胞TGF-β1蛋白表達而促進成纖維細胞增殖；②高碘導致的成纖維細胞增殖可能與BCS隔膜形成相關。

布-加綜合征；成纖維細胞；碘；細胞因子類；隔膜阻塞

隔膜阻塞型布-加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的特征是下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜形成，而隔膜的形成機制至今尚未闡明［1］。近年來國內流行病學研究發(fā)現(xiàn)，BCS高發(fā)區(qū)飲用水碘含量超標，其發(fā)病率與水碘含量呈正相關［2］?；A研究發(fā)現(xiàn)，BCS的隔膜組織主要由成纖維細胞、內皮細胞、膠原纖維等構成［3］；一定濃度的高碘培養(yǎng)環(huán)境能促進成纖維細胞、內皮細胞增殖［4］。另外，隔膜組織中轉化生長因子β受體（transforming growth factor-βreceptor，TGF-βR）表達明顯高于正常血管壁組織［5］。

本研究在體外高碘環(huán)境中培養(yǎng)成纖維細胞，研究高碘促成纖維細胞增殖作用與TGF-β1、TGF-βRⅠ的相關性，以探討B(tài)CS隔膜形成的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株培養(yǎng)

HFL1人肺成纖維細胞（目錄號GNHu28）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養(yǎng)于Corning培養(yǎng)皿中，使用F12K培養(yǎng)基（美國Sigma公司），加10%胎牛血清（美國Gibco公司）。于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，至細胞貼壁生長匯合即可傳代，選取第5～6代細胞用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細胞增殖情況取對數(shù)生長期的成纖維細胞，經(jīng)胰酶消化后制備成細胞懸液。用細胞計數(shù)板作細胞計數(shù)，測定細胞密度，再使用培養(yǎng)基稀釋至5×104個/ml。將TGF-βRⅠ抑制劑SD-208（Sigma公司）用二甲基亞砜（DMSO）溶解后再加入雙蒸水配成8.5mg/L工作溶液。將分析純碘化鉀（KI）配制成I-濃度為24 mg/L的工作溶液。將細胞懸液接種至96孔板中（密度約為5 000個/孔），分為5組：①空白對照組（每孔加入100μl細胞懸液和20μl F12K培養(yǎng)基），②溶媒組（每孔加入100μl細胞懸液、19μl F12K培養(yǎng)基和1μl DMSO），③KI組（每孔加入細胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基15μl和KI 5μl），④SD-208組（每孔加入細胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基15μl和SD-208 5μl），⑤SD-208和KI共同作用組（聯(lián)合組，每孔加入細胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基10μl、SD-208 5μl、KI 5μl）。以上各組均作6個復孔。其中③、⑤組I-終濃度為1 000μg/L，④、⑤組SD-208終濃度為1μmol/L。隨后于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，更換新的F12K培養(yǎng)基，每孔再加入CCK-8工作液10μl，孵育40min。以1個F12K培養(yǎng)基加CCK-8工作液孔作為本底調零，于450 nmol/L波長處測定各孔吸光度（A）值，間接反映細胞數(shù)量，各組A值均去除1個最高值和1個最低值。以上實驗重復3次。1.2.2 Western印跡法檢測TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達取對數(shù)生長期成纖維細胞1∶6傳代，培養(yǎng)48代后換液，設空白對照組和高碘組?？瞻讓φ战M直接使用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)；高碘組在F12K培養(yǎng)基中分別加入碘化鉀，使I-終濃度分別為250、500、1 000、2 000和3 000μg/L，再將細胞于培養(yǎng)箱中孵育12 h。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉膜和免疫反應。TGF-β1一抗（Abcam公司）以1∶500稀釋，TGF-βRⅠ一抗（Abcam公司）以1∶250稀釋，二抗稀釋比均為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍（BCIP/NBT）發(fā)色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進行半定量分析，以TGF-β1/β-acting，TGF-βRⅠ/β-acting的灰度值比值評定TGF-β1及TGF-βRⅠ蛋白表達水平。以上實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0軟件。檢測結果以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個實驗組與對照組比較采用最小顯著差法（LSD），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同條件影響成纖維細胞的增殖情況

空白對照組與溶媒組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KI組細胞增殖率明顯高于對照組，SD-208組細胞增殖率明顯低于對照組，聯(lián)合組細胞增殖率高于對照組但低于KI組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同條件影響成纖維細胞的增殖情況（±s）

表1 不同條件影響成纖維細胞的增殖情況（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

組別標本數(shù)成纖維細胞增殖率（A值）空白對照組18 1.06±0.13溶媒組18 1.02±0.11 KI組18 1.70±0.03aSD-208組18 0.52±0.10a聯(lián)合組18 1.29±0.41a

2.2 不同濃度I-對TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達的影響

與空白對照組比較，不同I-濃度組的TGF-βRⅠ蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但1 000、2 000μg/L I-濃度組的TGF-β1蛋白相對表達量明顯提高（P＜0.05），1 000μg/L與2 000μg/L I-濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2，圖1～3。

3 討論

我們曾檢測74例下腔靜脈隔膜阻塞型BCS患者下腔靜脈血液中TGF-β1濃度，發(fā)現(xiàn)明顯高于非BCS患者［6］。結合已發(fā)現(xiàn)的隔膜組織中TGF-βR表達明顯高于正常血管壁組織的結果［5］，我們認為TGF-β家族與BCS隔膜形成存在密切關系。TGF-β是一類促進細胞增殖和轉化的細胞因子超家族，是目前公認的對纖維化最重要的調控因子［7］。TGF-β1能促進成纖維細胞過度增殖、分化，繼而促進膠原蛋白等細胞外基質（ECM）在肺間質和肺泡間過度積聚［8］。

本研究中使用的SD-208為TGF-βRⅠ激酶抑制劑［9-10］，結果顯示KI組細胞增殖率明顯高于對照組，與張海濤等［4］發(fā)現(xiàn)的碘離子濃度≤3 000μg/L具有促進成纖維細胞增殖和抑制細胞凋亡作用的結果相符。本文中SD-208組細胞增殖率明顯低于對照組，表明成纖維細胞增殖依賴于TGF-β1和（或）TGF-βRⅠ作用。聯(lián)合組細胞增殖率低于KI組但仍高于對照組，表明高碘對成纖維細胞的促增殖作用不僅通過對TGF-β/TGF-βRⅠ途徑刺激而實現(xiàn)，還存在其他作用途徑。我們前期研究高碘促成纖維細胞增殖作用與堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）、成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）關系發(fā)現(xiàn)，高碘因素可通過對FGF/FGFR途徑刺激而促進成纖維細胞增殖［11］。

碘對成纖維細胞的增殖和凋亡具有雙向效應，較低濃度的碘離子對成纖維細胞增殖起明顯的促進作用，隨著碘離子濃度的升高促進作用逐漸消失，碘離子濃度較高時成纖維細胞增殖活性受到抑制。前期研究中發(fā)現(xiàn)高碘對成纖維細胞FGFR2蛋白表達也存在劑量-效應關系［11］。本研究中，Western印跡結果顯示，I-濃度1 000和2 000μg/L組TGF-β1蛋白表達明顯提高，表明高碘可通過上調TGF-β1蛋白表達量對成纖維細胞產(chǎn)生促增殖作用，但I-濃度3 000μg/L組的TGF-β1蛋白表達量低于1 000μg/L和2 000μg/L組，與對照組比較無明顯差異，說明高碘對成纖維細胞TGF-β1蛋白表達的影響也存在劑量-效應關系。各組中成纖維細胞TGF-βRⅠ蛋白表達量比較無明顯差異，表明高碘對成纖維細胞產(chǎn)生促增殖作用并非通過提高TGF-βRⅠ蛋白表達量實現(xiàn)。高碘對TGF-βR其他亞型的蛋白表達是否存在影響還需進一步證實。

表2 不同濃度I-對TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達的影響

圖1 TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白在不同中I-濃度中的表達

圖2 不同I-濃度對TGF-βRI蛋白相對表達量的影響

圖3 不同I-濃度對TGF-β1蛋白相對表達量的影響

TGF-β1的過度表達可強化TGF-β1/Smads信號轉導通路，能夠刺激成纖維細胞有絲分裂促進其增殖，并誘導其轉化為肌成纖維細胞而產(chǎn)生ECM［12］。另一方面，抑制基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等合成，促進蛋白酶抑制劑的合成以阻止基質降解，并調節(jié)細胞表面整合素的表達，以增強新生基質與細胞的黏附和組合，使新生基質得以穩(wěn)定和積聚［13］。TGF-β1的高表達可促進成纖維細胞的增殖和轉化導致ECM合成和沉積，穩(wěn)定新生基質，最終導致纖維化的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)高碘通過提高成纖維細胞TGF-β1蛋白表達量促進其增殖，這與BCS隔膜組織檢測到增殖的成纖維細胞、BCS患者下腔靜脈血液中高濃度TGF-β1結果相一致。另外，韓新強等［14］發(fā)現(xiàn)下腔靜脈隔膜阻塞型（MOVC）BCS患者下腔靜脈血液中VEGF的含量明顯高于正常人，而TGF-β1在刺激成纖維細胞增殖同時還能誘導成纖維細胞分泌內源性和外源性VEGF［15］。我們推測由于肝靜脈開口處的血流切應力、膈肌損傷等因素引起肝靜脈開口處血管壁損傷［16］，而患者血液中高碘因素促進損傷處成纖維細胞FGFR2蛋白表達量［11］和TGF-β1分泌，并通過細胞因子間的交互作用促進VEGF等表達提高，進而共同促進細胞增殖、遷移。因此，高碘導致的成纖維細胞增殖可能與隔膜形成存在相關性。

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The effect of TGF-β1，TGF-βRI and high concentration iod ine in the promotion of fibroblast proliferation：correlation study

HUA Qian-jin，ZU Mao-heng，HU Lin，ZHUANG Yin-ping. Department of Interventional Radiology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu Province 22l002，China

ZUMao-heng，E-mail:cjr.zumaoheng@vip.163.com

ObjectiveTo study the relationship between transforming growth factor-β1（TGF-β1），transforming growth factor-βreceptorⅠ（TGF-βRⅠ）and high concentration iodine in promoting fibroblast proliferation so as to explore the pathogenesis of the membranous formation in Budd-Chiari syndrome.M ethods The experiment included five groups：blank control group，solvent group，KI group，TGF-βRⅠinhibitor group（SD-208）and SD-208 plus KI combination group.①Fibroblasts were cultured in high content of iodine and treated with TGF-βRI inhibitor then the fibroblast proliferation activity was determined by CCK-8 assy.②The protein expressions of TGF-β1 and TGF-βRⅠof fibroblasts in different concentrations of iodine（0，250，500，1 000，2 000 and 3 000 ug/L）were determined by Western-blotmethod.Results①When the culture solution was of 1 000 ug/L iodine concentration，the cell proliferation rate of the SD-208 plus KI combination group（A：1.29±0.41）was significantly higher than that of the control group（0.52± 0.10），but significantly lower than that of the KIgroup（1.70±0.03）with P＜0.05.②Fibroblast TGF-β1 protein relative expression levels in the groups with the iodine concentration of 1 000 ug/L and 2 000 ug/L were significantly higher than those of the other groups（P＜0.05）.No significant difference in fibroblast TGF-βRⅠprotein relative expressions existed between each other groups（P＞0.05）.Conclusion①High concentration of iodinemay promote the proliferation of fibroblasts through raising TGF-β1 protein expression.②Theproliferation of fibroblasts caused by high concentration of iodinemay be related to themembranous formation in Budd-Chiarisyndrome.（JIntervent Radiol，2014，23：431-434）

Budd-Chiari syndrome；fibroblast；iodine；cytokine；membranous obstruction

R543.6

B

1008-794X（2014）-05-0431-04

2013-10-22）

（本文編輯：侯虹魯）

江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉化專項基金資助項目（BL2012021）；徐州醫(yī)學院研究生科技創(chuàng)新工程研究項目（XYLC-1220）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.016

221002徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院介入放射科（華淺近、祖茂衡、胡琳）；徐州醫(yī)學院醫(yī)學影像學院布-加綜合征實驗室（莊銀蘋）

祖茂衡E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com