藥物洗脫球囊抑制下肢動脈狹窄性病變的實(shí)驗(yàn)研究

張文俐，杜潤，朱政斌，朱勁舟，應(yīng)晨，劉慧竹，張瑞巖

·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·

藥物洗脫球囊抑制下肢動脈狹窄性病變的實(shí)驗(yàn)研究

張文俐，杜潤，朱政斌，朱勁舟，應(yīng)晨，劉慧竹，張瑞巖

目的探討新型藥物洗脫球囊（DEB）在下肢動脈狹窄性病變（PAD）中可能具有的抑制管腔丟失、減少內(nèi)膜增生作用。方法以雄性新西蘭純種兔（體重2.5～3.0 kg）為實(shí)驗(yàn)對象，于兔腹主動脈近心端及遠(yuǎn)心端各植入Mustang裸支架1枚，模擬PAD模型，并分別用裸球囊（PTA組）及藥物洗脫球囊（DEB組）在血管支架段行后擴(kuò)張，術(shù)后28 d處死動物，收集腹主動脈支架標(biāo)本，塑料包埋并行Masson染色，比較各組內(nèi)膜增生程度，同時行DEB藥物（紫杉醇）靶點(diǎn)β-微管蛋白免疫組化檢測。結(jié)果形態(tài)學(xué)上，與PTA組比較，DEB組內(nèi)膜增生及管腔狹窄率明顯下降。同時β-微管蛋白免疫組化檢測顯示，與PTA組相比，DEB組血管內(nèi)膜β-微管蛋白表達(dá)量顯著增加。結(jié)論動物實(shí)驗(yàn)初步顯示，DEB具有潛在的有效地抑制管腔丟失、減少內(nèi)膜增生作用，初步證實(shí)該新型DEB的優(yōu)良性能，提示該新型DEB遠(yuǎn)期應(yīng)用于臨床治療PAD的潛在可能性。

下肢動脈狹窄性病變；藥物洗脫球囊；紫杉醇；內(nèi)膜增生

下肢動脈狹窄性病變（PAD）主要分為動脈栓塞和血栓形成兩類，主要原因多為動脈粥樣硬化引起，常導(dǎo)致下肢血液供需不足、疼痛、下肢無脈、間歇性跛行等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致重癥肢體缺血，面臨截肢風(fēng)險，需要及早進(jìn)行治療［1］。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變和人口老齡化，PAD的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是伴有糖尿病的患者，遠(yuǎn)端血管病變更為常見，嚴(yán)重影響了患者的健康和生活水平［2-3］。

血管介入治療以其創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、恢復(fù)快，現(xiàn)已成為臨床醫(yī)師治療PAD的首選方法［4］。介入治療的發(fā)展經(jīng)歷了經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)、裸支架成形術(shù)（BMS）、藥物涂層支架成形術(shù)（DES）、粥樣斑塊旋切術(shù)、經(jīng)皮機(jī)械血栓消融等過程。但由于PAD具有病變彌漫，血管迂曲等特點(diǎn)，限制了以上技術(shù)的應(yīng)用［1］。

球囊擴(kuò)張方法相對簡單，操作時間短，一次可治療多支動脈狹窄或1支動脈多處狹窄，且較少受動脈管徑和部位的限制，大小動脈、關(guān)節(jié)彎曲處、動脈分叉處、長段狹窄都可施行球囊擴(kuò)張治療。但鑒于一些病變血管壁回彈力高、管壁硬度大等原因，下肢動脈狹窄單純球囊擴(kuò)張1年后再狹窄率高達(dá)32%［5］。為克服球囊擴(kuò)張成形術(shù)后靶病變血管的高再狹窄發(fā)生率，藥物涂層球囊（DEB）導(dǎo)管系統(tǒng)成為研究熱點(diǎn)。國外關(guān)于DEB對PAD治療作用的研究已取得令人滿意的結(jié)果，并已有成型商品在臨床應(yīng)用。

目前，國內(nèi)尚無治療PAD的DEB產(chǎn)品問世。本研究依托微創(chuàng)醫(yī)療（上海）器械有限公司成熟的生產(chǎn)與研發(fā)體系，自主開發(fā)新型紫杉醇涂層球囊（DEB）系統(tǒng)，并研究其對PAD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物用藥與分組

采用雄性新西蘭大白兔5只，體重2.5～3.0 kg，正常飼料喂養(yǎng)7 d。術(shù)前3 d至術(shù)后7 d每天給予阿司匹林100 mg和噻氯匹定500mg灌胃；術(shù)后7 d每天給予阿司匹林100 mg灌胃，直到動物處死。采用隨機(jī)信封法，將實(shí)驗(yàn)分為PTA及DEB處理組，于兔腹主動脈近心端及遠(yuǎn)心端各植入Mustang裸支架（微創(chuàng)醫(yī)療器械（上海）有限公司）1枚，并分別用PTA及DEB球囊（2.0mm×18mm）行后擴(kuò)張。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)操作所有動脈造影、支架植入以及球囊擴(kuò)張均在血管造影機(jī)下完成（INNOVA2100，GE，USA）。實(shí)驗(yàn)兔用2.5%戊巴比妥鈉1ml/kg行耳緣靜脈注射麻醉后，置于動物臺上，消毒，鋪巾，外科學(xué)方法暴露右側(cè)下肢股動脈，18 G穿刺針穿刺后引入0.014英寸指引鋼絲（Runthrough，Terumo，Tokyo，Japan），按照支架直徑∶血管直徑1.1∶1比例植入Mustang裸支架，釋放壓力12～18 atm；送入球囊導(dǎo)管系統(tǒng)，以球囊直徑∶血管直徑1.1～1.2∶1比例，16～18 atm擴(kuò)張球囊使之與血管壁緊密接觸并持續(xù)2 min，釋放壓力維持1 min，再次相同壓力擴(kuò)張球囊1次，維持1 min；最后撤出球囊，局部創(chuàng)口3/0針線縫合。

1.2.2 標(biāo)本制備和形態(tài)學(xué)觀察于術(shù)后4周按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處死動物，取其支架覆蓋段血管置于4%甲醛溶液中固定。首先取部分血管用于Masson大體染色，標(biāo)本行丙酮脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋，硬組織切片機(jī)切片（EXAKT公司德國）、打磨，Masson染色，Zeiss顯微鏡下觀察內(nèi)膜增生情況。利用AxioVision 4.7（Carl Zeiss MicroImaging德國）圖像分析軟件將10倍物鏡下的血管橫切面圖像，拼接成完整的血管腔，逐步測算血管腔面積、內(nèi)彈力膜截面積，得出新生內(nèi)膜面積及管腔狹窄百分比，并測量血管橫截面每枚支架片段外側(cè)至血管腔面的距離，取平均值得出新生內(nèi)膜厚度。同時參照經(jīng)典文獻(xiàn)對血管損傷程度及管壁炎性指數(shù)進(jìn)行評分。損傷評分如下：①每枚支架片段貼于血管中膜；②每枚支架片段浸入血管中膜，但未穿透；③每枚支架片段穿透血管中膜；最終取總分的平均值。炎性評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：每枚支架片段周圍無炎性細(xì)胞；1分：每枚支架片段周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤；2分：每枚支架片段周圍有中量炎性細(xì)胞浸潤；3分：每枚支架片段周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤；4分：支架片段周圍存在肉芽腫，最終取總分平均值。

1.2.3 免疫組化檢測另取部分血管行紫杉醇作用靶點(diǎn)β-微管蛋白（β-tublin）免疫組化檢測。標(biāo)本縱向剪開后，于顯微鏡下用微型手術(shù)器械小心分離其中支架部分，注意不要損傷內(nèi)膜組織。血管標(biāo)本常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，并制成5μm厚切片，65℃烤片過夜。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，3%H2O2中浸泡8 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中微波爐加熱10 min行抗原熱修復(fù)，緩慢冷卻至室溫，PBS清洗2次，5% BSA封閉液室溫20 min以封閉非特異性抗原，滴加1∶200稀釋的β-tublin一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗2 min，連續(xù)3次，后滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min，連續(xù)3次，再滴加SABC，37℃孵育20min，PBS清洗5min，連續(xù)4次，最后DAB顯色5 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下細(xì)胞膜顯示為棕黃色為陽性細(xì)胞，并用Image Pro-Plus（IPP）軟件統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞所占比率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用T檢驗(yàn)。所有指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

4周中實(shí)驗(yàn)動物全部存活至終點(diǎn)，無不良事件發(fā)生。

2.1 靶血管形態(tài)學(xué)變化

對各組標(biāo)本行Masson大體染色發(fā)現(xiàn)，Mustang裸支架植入伴不同球囊擴(kuò)張后4周，PTA組內(nèi)膜增生及管腔狹窄均較明顯，考慮為支架植入術(shù)后的再狹窄效應(yīng)。與PTA組比較，DEB組內(nèi)膜增生及管腔狹窄率明顯下降；管壁炎性反應(yīng)評分方面，各組之間炎性反應(yīng)評分趨向一致（圖1，表1）。

圖1 裸支架植入伴不同球囊擴(kuò)張后4周血管標(biāo)本Masson大體染色結(jié)果

表1 不同球囊處理組各種測量值比較

2.2 β-微管蛋白（β-tublin）檢測

對各組血管標(biāo)本行紫杉醇作用靶點(diǎn)β-微管蛋白（β-tublin）免疫組化檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PTA組相比較，DEB組血管內(nèi)膜β-tublin表達(dá)量顯著增加，提示紫杉醇經(jīng)球囊擴(kuò)張后有效潴留于血管內(nèi)膜并發(fā)揮生物學(xué)作用（圖2）。

圖2 裸支架植入伴不同球囊擴(kuò)張后4周血管壁β-微管蛋白（β-tublin）免疫組化檢測結(jié)果

3 討論

DEB治療動脈狹窄性病變的作用機(jī)制類似于藥物涂層支架，都是通過攜帶藥物抑制內(nèi)膜增生。目前最常用的藥物是紫杉醇，可通過抑制微管蛋白聚集，阻斷細(xì)胞有絲分裂過程，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增生的作用［6-7］。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，動脈狹窄性病變是一個慢性過程，必須通過局部藥物的持續(xù)性釋放方可有效預(yù)防再狹窄。然而，后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)顯示，將加入親脂性紫杉醇的對比劑與培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行共孵育，即使短暫的3 min培養(yǎng)即可完全抑制血管平滑肌增生，并且時間可達(dá)2周［8］。隨后的動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，術(shù)中使用加入紫杉醇的對比劑以及紫杉醇包被球囊（擴(kuò)張1 min），即可使得血管壁中紫杉醇的濃度達(dá)到抗細(xì)胞增殖的濃度（使超過90%藥物進(jìn)入血流），從而顯著降低再狹窄的發(fā)生，這種效果甚至好于藥物涂層支架，這可能是由于支架本身的結(jié)構(gòu)即可造成血管損傷反應(yīng)，而球囊表面的光滑既避免了操作本身帶來的損傷，又保證了藥物平穩(wěn)均勻釋放和接觸［9］。

正是基于上述研究結(jié)果，關(guān)于DEB的研發(fā)得到了長足的發(fā)展。DEB治療PAD亦是基于以下理論：①脂溶性的紫杉醇能迅速被血管組織攝取達(dá)到血藥濃度，抗增殖藥物的持續(xù)釋放對抑制再狹窄的炎性反應(yīng)進(jìn)程來說并非必要，可減少血栓形成［10］；②藥物短期暴露即可明顯阻斷早期的增生啟動因子；③紫杉醇涂層球囊采用了特殊的載體——對比劑溶液或尿素或納米技術(shù)，避免了藥物涂層支架表面的聚合物載體（polymer）對內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和愈合過程的抑制，起到抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的功能。本研究顯示DEB處理組血管壁上β-微管蛋白表達(dá)量顯著增高，再次說明DEB可通過其攜帶藥物紫杉醇達(dá)到抑制血管內(nèi)膜增生的作用。

國外關(guān)于DEB的臨床研究顯示，DEB在治療小動脈（血管直徑為2～8 mm或更?。┆M窄時，其術(shù)后再狹窄發(fā)生率為5.5%，顯著低于裸球囊治療的31%的血管再狹窄發(fā)生率［11-12］。更深入的研究顯示，DEB可減少血管壁細(xì)胞的生長，裸球囊治療的血管增生厚度為0.3～0.75 mm，而DEB治療的血管增生厚度為0.2 mm或更少，血管增生厚度的降低最終導(dǎo)致主要不良血管事件的發(fā)生率減少［6］。2009年1月Invatec公司的外周球囊新產(chǎn)品IN.PACT Amphirion紫杉醇洗脫球囊導(dǎo)管在歐洲批準(zhǔn)上市，其是首個專用于治療膝部以下（BTK）動脈粥樣硬化的DEB。

目前國內(nèi)尚無治療PAD的DEB產(chǎn)品問世。本研究依托微創(chuàng)醫(yī)療（上海）器械有限公司成熟的生產(chǎn)與研發(fā)體系，自主開發(fā)治療PAD的DEB系統(tǒng)。本次動物研究初步顯示該新型DEB對PAD具有較好的治療作用，但尚需臨床實(shí)驗(yàn)為其提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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The inhibition effect of novel drug-eluting balloon on obstructive peripheral arterial disease of lower extrem ity：an experimental study in rabbitmodels

ZHANGWen-li，DU Run，ZHU Zheng-bin，ZHU Jin-zhou，YING Chen，LIU Hui-zhu，ZHANG Rui-yan.Department of Cardiology，Affiliated Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200025，China

ZHANG Rui-yan，E-mail：zhangruiyan@263.net

ObjectiveTo investigate the possible inhibition effect of a domestic novel drug-eluting balloon（DEB），such as controlling the vascular stenosis and reducing the intimal hyperplasia，on obstructive peripheral arterial disease（PAD）of lower extremity.M ethods Male New Zealand rabbits（weighted 2.5-3.0 kg）were used for this study.Mustang baremetal stents（BMS）were separately implanted at both the proximal and distal site of abdominal aorta to establish the PADmodels in rabbits.Bare balloon（PTA group）or drug-eluting balloon（DEB group）was separately used to dilate the stent segment of the aorta.The animals were sacrificed 28 days after the treatment.The aorta stent specimenswere collected and sent for pathologic examination.Using Masson staining method the degree of intimal hyperplasia was estimated and the expression level of paclitaxel-targetedβ-tubulin was determined with immunohistochemical method.The results were compared between the two groups.Results Morphologically，both the degree of intimal hyperplasia and the vascular stenosis rate in DEB group were significantly lower than those in PTA group.Meanwhile，immunohistochemical examination of paclitaxel-targetedβ-tubulin indicated that its expression level in DEB group was obviously higher than that in PTA group.Conclusion This experimental study indicates that the domestic novel DEB has potential inhibition effect in respectof controlling the loss of lumen as well as reducing the intimal hyperplasia.This novel DEB carries excellent property，suggesting the possibility to use DEB in clinical treatment of PAD.（J Intervent Radiol，2014，23：423-426）

obstructive arterial disease of lower extremity；drug-eluting balloon；paclitaxel；intimal hyperplasia

R543.5

B

1008-794X（2014）-05-0423-04

2013-09-15）

（本文編輯：侯虹魯）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.014

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科通信作者：張瑞巖E-mail：zhangruiyan@263.net