糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用研究

湯琳

(上海市環(huán)境監(jiān)測中心，上海 200030)

糞大腸菌群，一群能在44.5±0.5℃溫度下生長，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，國外又稱耐熱大腸菌群。主要來源于人畜糞便，可導(dǎo)致腸道傳染病傳播，如傷寒、霍亂、細(xì)菌性痢疾、脊髓灰質(zhì)炎和傳染性肝炎等，是水質(zhì)污染的重要監(jiān)測指標(biāo)之一［1－2］。因此，不斷優(yōu)化糞大腸桿菌的檢測方法具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。酶底物法作為一種新興的糞大腸菌群檢測方法，具有準(zhǔn)確、快速、可靠的檢測特點(diǎn)，對(duì)及時(shí)反映監(jiān)測水域糞便污染狀況，有效預(yù)報(bào)和控制流行疾病的發(fā)生與傳播具有重要意義。

1 研究背景

水體微生物污染狀況日趨嚴(yán)重，作為水體污染重要組成內(nèi)容，微生物污染集中體現(xiàn)在糞便污染，糞便是病原微生物、病毒、原生動(dòng)物和蠕蟲的主要來源，可導(dǎo)致人類腸道傳染病傳播(WHO的飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則)。1992年，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)修訂會(huì)議上首次提出將糞大腸菌群作為糞便污染的重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，與菌落總數(shù)、總大腸菌群和大腸埃希氏菌共同作為糞便污染的微生物監(jiān)測指標(biāo)。

然而，實(shí)際工作中，尤其是在應(yīng)急監(jiān)測中，監(jiān)測部門無法對(duì)水體中各種致病微生物進(jìn)行檢測。故絕大多數(shù)時(shí)候，通過糞大腸菌群的檢測來評(píng)價(jià)水體污染情況，從而反映對(duì)人體健康的危害大小。正是糞大腸菌群在監(jiān)測中的代表性，使其在國內(nèi)各類標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用廣泛。不同標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用情況和限值具體見表1。

由表可見，從檢測意義上來說，推廣快速、簡便的糞大腸菌群酶底物檢測法對(duì)不同行業(yè)的水質(zhì)監(jiān)測具有重要意義。

2 酶底物法解析

表1 各類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的糞大腸菌群限值

2.1 酶底物法介紹

酶底物法［7］，利用糞大腸菌群在 44.5℃生長過程中產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶和β－葡萄糖醛酸酶，分解培養(yǎng)液中的鄰硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷(ONPG)和β－葡萄糖醛酸，使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃色和熒光反應(yīng)(陽性)這一原理進(jìn)行檢測，最后根據(jù)陽性的組合，查MPN表得出數(shù)量。

實(shí)際操作中，首先需要根據(jù)水樣的污染程度對(duì)待測水樣作適當(dāng)稀釋，然后用無菌瓶取混勻水樣100 mL，加入 Colilert(科立得)試劑1份，溶解混勻，倒入97孔定量盤，封口，于44.5±0.2℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后根據(jù)陽性孔數(shù)，查MPN表并計(jì)算。

酶底物法在美國最早得到推廣和應(yīng)用，用酶底物法檢測糞大腸菌群、總大腸菌群和大腸埃希氏菌已獲得美國EPA認(rèn)證，在美國、歐洲、日本等地得到廣泛的應(yīng)用。在中國，2006年頒布的《生活飲用水國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750.12－2006)中將酶底物法列為總大腸菌群的國標(biāo)方法，但尚未作為糞大腸菌群監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.2 酶底物法與其他方法比較

國內(nèi)檢測糞大腸菌群一直沿用國外早期的實(shí)驗(yàn)方法，以MPN法和濾膜法傳統(tǒng)方法為主［4］。隨著生物監(jiān)測技術(shù)發(fā)展，紙片法、固定酶底物法、分子生物學(xué)鑒定法等方法相繼出現(xiàn)并得到了一定范圍的應(yīng)用。各檢測方法比較見表2。

表2 糞大腸菌群各檢測方法比較

從實(shí)驗(yàn)操作上，酶底物法取樣加藥后封口培養(yǎng)，過程簡單，較少受人為污染，雖然紙片法操作也較簡便，但操作過程易受污染，且需要確證試驗(yàn);從結(jié)果反映上，酶底物法97孔定量盤的最大可能數(shù)表卻有2 352組，比其他方法的最大可能數(shù)表(多管發(fā)酵法56組)查表時(shí)更為準(zhǔn)確。此外，酶底物法應(yīng)用酶技術(shù)進(jìn)行糞大腸菌群檢測，出現(xiàn)假陰性、假陽性現(xiàn)象較少;綜上可見，酶底物法相對(duì)于其他檢測方法更為準(zhǔn)確。

3 酶底物法的應(yīng)用和研究狀況

3.1 酶底物法的應(yīng)用

糞大腸菌群作為衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在不同行業(yè)都有監(jiān)控要求，酶底物法作為糞大腸菌群的新興檢測方法，在標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用見表3。

表3 檢測糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法調(diào)研

由表3可見，目前國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)糞大腸菌群的檢測以多管發(fā)酵法為主，沒有酶底物法的規(guī)定應(yīng)用。由此可見，不斷強(qiáng)化酶底物法檢測糞大腸菌群的檢測，推廣酶底物法的應(yīng)用，可以填補(bǔ)國家在糞大腸菌群快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)上的空白，也為滿足當(dāng)前和今后一定時(shí)期內(nèi)國家環(huán)境保護(hù)工作的需要做好鋪墊。

3.2 酶底物法的研究現(xiàn)狀

酶底物法在美國最早得到推廣和應(yīng)用，用酶底物法檢測糞大腸菌群已獲得美國EPA認(rèn)證，在美國、歐洲、日本等地得到廣泛的應(yīng)用。雖然該法并未成為中國檢測糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法，但并未阻止許多學(xué)者對(duì)其的研究。高瑞坤等［14］比較了固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法來檢測水中糞大腸菌群，結(jié)果表明，兩種方法用于水中糞大腸菌群檢測結(jié)果具有一致性;崔松陽等［15］結(jié)合3家單位數(shù)據(jù)對(duì)比，說明了DST－酶底物法和多管發(fā)酵法檢測糞大腸菌群的一致性;遇曉杰等［4］認(rèn)為固定底物酶底物法與傳統(tǒng)多管發(fā)酵法沒有區(qū)別;段玉林等［16］用酶底物法對(duì)地表水水樣進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋后進(jìn)行培養(yǎng)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確掌握水樣稀釋倍數(shù)對(duì)測定結(jié)果就越準(zhǔn)確。此外，在四川5.12抗震救災(zāi)［8］中，酶底物法被用來檢測生活飲用水中的耐熱大腸菌群，成功保障了廣大災(zāi)區(qū)人民群眾生活飲用水的供水安全，在應(yīng)急監(jiān)測中發(fā)揮了重要的作用。

所有以上相關(guān)研究表明，酶底物法可以作為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的快速標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。

3.3 酶底物法應(yīng)用前景

酶底物法操作簡便，結(jié)果快速準(zhǔn)確，在環(huán)境監(jiān)測中具有廣泛的應(yīng)用前景，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：(1)糞大腸菌群作為環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，具有實(shí)際監(jiān)測意義，故酶底物法作為糞大腸菌群的快速檢測方法，滿足應(yīng)用需求;(2)傳統(tǒng)糞大腸菌群監(jiān)測方法操作繁瑣，需要48～72 h才能獲取結(jié)果，需要專業(yè)人員和專業(yè)檢測條件，水樣保存時(shí)間苛刻，在中西部地區(qū)執(zhí)行率不高，分子技術(shù)儀器要求高，且需要專業(yè)人員操作，明顯不適用環(huán)境污染事故監(jiān)測的要求;(3)酶底物法測定水樣中的糞大腸菌群具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，無需清洗玻璃器皿，無需無菌室，無需配置培養(yǎng)基，24 h內(nèi)定量檢測，極大地減少了工作量，同時(shí)可以避免使用多管法時(shí)逐級(jí)稀釋帶來的操作誤差，也避免了使用濾膜法時(shí)肉眼讀數(shù)的人為誤差，能夠較為準(zhǔn)確地判斷水樣的污染狀況;(4)現(xiàn)有糞大腸菌群監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)中未有酶底物法的規(guī)定，而酶底物法已經(jīng)被世界各國及地方實(shí)驗(yàn)室和世界各組織機(jī)構(gòu)認(rèn)可［17］，中國急需將檢測標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，探索和完善適用本國環(huán)境監(jiān)測的糞大腸菌群酶底物法。

4 總結(jié)

酶底物法根據(jù)糞大腸菌群的特異性酶，與特異性底物反應(yīng)，通過顏色變化和熒光作為檢測結(jié)果的判斷依據(jù)，操作簡便，結(jié)果直觀、清晰、可靠，客觀性強(qiáng)，缺點(diǎn)是使用的培養(yǎng)基只有國外生產(chǎn)商供應(yīng)，檢測成本較高。相信今后在科學(xué)研究上的不斷強(qiáng)化，使酶底物法的培養(yǎng)基逐漸實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，從而降低使用成本，使其具有更廣闊的應(yīng)用范圍和前景，作為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的快速標(biāo)準(zhǔn)檢測方法在日常監(jiān)測和應(yīng)急監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。

［1］國家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測分析方法［M］.4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：701－706.

［2］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998：15－16.

［4］遇曉杰，謝平會(huì)，焦艷玲，等.固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法檢測水中耐熱大腸菌群的比較研究［J］.衛(wèi)生監(jiān)測與檢驗(yàn)，2012，28(2)：251 －252.

［5］張濟(jì)龍，何吉明，何敏.水中糞大腸菌群檢測方法及其研究進(jìn)展［J］.青海環(huán)境，2012，23(2)：89－92.

［6］胥學(xué)鵬.水中糞大腸菌群測定的濾膜法研究［J］.環(huán)境檢測，2012：53－55.

［7］張少鋒，劉國強(qiáng).糞大腸菌群檢測方法及研究進(jìn)展［J］.海洋通報(bào)，2008，27(3)：102 －106.

［8］蔡炯，周蕾，梁娜，等.酶底物法快檢技術(shù)在四川5·12地震災(zāi)區(qū)生活飲用水監(jiān)測中的應(yīng)用［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(6)：1327 －1328.

［9］董雪，任羽光，韓桂春，等.紙片快速法監(jiān)測地表水中糞大腸菌群的探討［J］.環(huán)境與健康雜志，2003，2(20)：119 －120.

［10］趙凌宇.糞大腸菌群快速測定－紙片法的應(yīng)用［J］.環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2007，19(4)：18 － 20.

［11］POULSEN L K，LAN F，KRISTENSEN C S，et al.Spatial distribution of Escherichia coli in the mouse large intestine in ferred from rRNA in situ hybridization ［J］.Infect Immun，1994，62：5191－5194.

［12］REGNAULT B，MARTIN D S，LEJAY C M，et al.Oligonucleotide probe for the visualization of Escherichia coli/Escherichia fergusoni cells by in situ hybridization：sp EC ificity and potential applieation［J］.Res Microbial，2000，151：521 －533.

［13］PRESCOTT A M，F(xiàn)RICKER C R.Use of PNA oligonucleotides for the in situ detection of Escherichia coli in water［J］.Mol Cell Probes，1999，13：261 －268.

［14］高瑞坤，湯琳.水中糞大腸菌群快速檢測方法－固定底物酶底物法的比較［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，2008，6(4)：39 －41.

［15］崔松陽，饒欠平，藍(lán)先標(biāo).固定底物酶底物法檢測糞大腸菌群在生活污水中的應(yīng)用推廣［J］.環(huán)境，2009：60－61.

［16］段玉林，張少梅，溫韜，等.酶底物法快速測定地表水中糞大腸菌群的研究［J］.環(huán)境研究與監(jiān)測，2011，12(4)：37 －38.

［17］高瑞坤.美國環(huán)保署的大腸菌群檢測技術(shù)［J］.福建分析測試，2006，15(2)：36 －37.