細(xì)胞定量國際比對CCQM-P102及流式細(xì)胞技術(shù)的不確定度評定

張 玲， 王 晶， 陳大舟， 隋志偉， 劉新海

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院，北京 100022）

細(xì)胞定量國際比對CCQM-P102及流式細(xì)胞技術(shù)的不確定度評定

張 玲1， 王 晶1， 陳大舟1， 隋志偉1， 劉新海2

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院，北京 100022）

對中國計(jì)量科學(xué)研究院應(yīng)邀參加2010年CCQM-P102“具有特定表型的細(xì)胞定量測量比對”的測量過程、數(shù)據(jù)分析及不確定度評定進(jìn)行了闡述。比對結(jié)果表明，中國計(jì)量科學(xué)研究院CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)測量結(jié)果與各參加國達(dá)到等效一致，成績良好；其測量細(xì)胞平均CD4抗原值的細(xì)胞熒光強(qiáng)度值在經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換及線性回歸后，計(jì)算結(jié)果在國際比對不確定度范圍內(nèi)，并作為該比對提交測量不確定度的3個國家之一。對流式細(xì)胞術(shù)的測量不確定度評定進(jìn)行了探討。

計(jì)量學(xué)；流式細(xì)胞術(shù)；CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)；國際比對；不確定度

1 前 言

表面抗原分化簇4（CD4＋）是一類位于輔助性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的糖蛋白。對CD4＋T細(xì)胞的測量是艾滋病毒感染患者的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測的重要工具［1］。2007年世衛(wèi)組織公布，CD4細(xì)胞數(shù)小于200個／μL的血液細(xì)胞即診斷為獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）［2］。2005年世衛(wèi)組織對CD4 T細(xì)胞測量公開聲明，所有的CD4＋T細(xì)胞的計(jì)數(shù)技術(shù)需要與外部質(zhì)控和評估程序相一致［3］。啟動和切換治療方案的決定主要基于CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和臨床研究結(jié)果，因此，可靠的CD4測量結(jié)果是治療艾滋病患者的前提。

2010年CCQM生物工作組針對流式細(xì)胞法測量CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)及人外周血單核細(xì)胞表面的CD4抗原測量的準(zhǔn)確性和可比性，進(jìn)行了代號為P102的國際比對。該比對由英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所（NIBSC）、德國物理技術(shù)研究院（PTB），美國國家技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)研究院（NIST）聯(lián)合主導(dǎo)，8個國家的15個實(shí)驗(yàn)室參加，在12種不同的儀器、平臺和3種不同的計(jì)數(shù)技術(shù)上實(shí)施了該比對。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

試劑：Na2HPO4、NaH2PO4，分析純，北京毅力精細(xì)化工有限公司；磷酸，MOS級，北京化學(xué)試劑公司；高純?nèi)ルx子水，密理博公司MilliQ純水儀制備，用于制備細(xì)胞懸液的緩沖液。

儀器：FC500流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）；CP324S天平（量程320 g，精度0.1 mg，Sartorius，德國），用于溶液的配制及移液器的校準(zhǔn)；MS3型漩渦振蕩器（IKA，德國），用于細(xì)胞混勻。移液器（200μL、1 000μL，Eppendorf，德國），用于移取樣品，配制溶液。

比對樣品：2010年5月收到樣品，包括4管預(yù)標(biāo)記的凍干細(xì)胞，8管細(xì)胞數(shù)量校準(zhǔn)微球，1管熒光彩虹校準(zhǔn)微球。按比對要求存放溫度為4°C。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品

比對主辦方提供的細(xì)胞數(shù)量校準(zhǔn)微球（TruCount Tube），出自BD（Becton，Dickinson and Company）公司；熒光彩虹校準(zhǔn)微球（rainbow），出自NIST。均未提供不確定度。

2.3 樣品前處理

細(xì)胞凍干粉溶于1mL滅菌去離子水中，溫和漩渦混勻10～30 min。該細(xì)胞已預(yù)先由異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面CD4抗原蛋白結(jié)合、固定后凍干。該比對以FITC熒光強(qiáng)度代表CD4細(xì)胞表面抗原含量的多少。

3管1∶5稀釋樣品：取200μL溶解的細(xì)胞懸液于TruCount Tube微球校準(zhǔn)管中，加入800 μL磷酸鹽緩沖液（PBS pH 7.2～7.4），溫和混勻并保證細(xì)胞和微球凍干粉充分懸浮、均勻分散于溶液中。

3管1∶20稀釋樣品：取50μL溶解的細(xì)胞懸液于TruCount Tube微球校準(zhǔn)管中，加入950μL磷酸鹽緩沖液（PBS pH 7.2～7.4），溫和混勻并保證細(xì)胞和微球凍干粉充分懸浮、均勻分散于溶液中。

上述懸液存放于4°C，并在2h內(nèi)分析。

2.4 測量方法

加2～3滴空白顆粒和熒光彩虹校準(zhǔn)顆粒到0.5 mL磷酸緩沖液PBS中，在流式細(xì)胞儀上以圖1中圈門P1的方式確保熒光最強(qiáng)的那群細(xì)胞都圈在檢測窗里，獲取至少20 000個顆粒檢測事件。并按圖2分析該群顆粒，F(xiàn)ITC為異硫氰酸熒光素，將5種不同熒光強(qiáng)度的顆粒區(qū)分開來（P2～P6），記錄每一群顆粒的熒光的幾何平均值作為其等量熒光強(qiáng)度值E［4～6］。圖中散射光和熒光信號強(qiáng)度均為儀器光電倍增管返回的信號強(qiáng)度數(shù)值，單位為1，下同。

圖1 熒光校準(zhǔn)顆粒的圈門

圖2 熒光校準(zhǔn)顆粒分群記錄其熒光強(qiáng)度值

對于本文實(shí)驗(yàn)部分第2.3節(jié)中制備的外周血細(xì)胞樣品，圖3用側(cè)向角散射光的觀察方式圈出CD4＋細(xì)胞P1。圖4用熒光檢測的方式圈出校準(zhǔn)顆粒P2，PE為藻紅蛋白熒光素。1次測量中至少獲得10 000個顆粒檢測事件。圖5記錄CD4＋細(xì)胞P1的熒光強(qiáng)度值E（P3）。

2.5 數(shù)據(jù)分析

圖3 CD4＋細(xì)胞的圈門

圖4 細(xì)胞數(shù)量校準(zhǔn)顆粒的圈門

圖5 CD4＋細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)的計(jì)算式為式中，P1為細(xì)胞檢測數(shù)；P2為顆粒檢測數(shù)；B為比對主導(dǎo)方提供的細(xì)胞數(shù)量校準(zhǔn)顆粒，其值為51511個／管；V為測量體積，其值為1 mL；F為稀釋因子，實(shí)驗(yàn)中為稀釋5倍。

CD4＋細(xì)胞所帶的CD4抗原以等量熒光素?zé)晒庵礒表示，用熒光校準(zhǔn)顆粒所得熒光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在該曲線上得到CD4＋細(xì)胞的E值。

3 結(jié)果與討論

3.1 CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，共分析3瓶樣品，每個樣品平行測量3次。并用式（1）計(jì)算細(xì)胞個數(shù)，表1為中國計(jì)量科學(xué)研究院測量結(jié)果。

表1 NIM CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果個／μL

參加比對實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果見圖6，圖中上下2條虛線分別為95%置信區(qū)間不確定度范圍，橢圓形圈出的實(shí)驗(yàn)室J為中國計(jì)量科學(xué)研究院的測量結(jié)果。CCQM公布的CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值為307.3個／μL，擴(kuò)展不確定度為246.7～356.8個／μL（p＝95%）。中國計(jì)量科學(xué)研究院給出的測量結(jié)果為（320±28）／μL（k＝2），接近中心值，且數(shù)據(jù)分散性小。

圖6 CCQM-P102 CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)比對結(jié)果分布圖

3.2 CD4＋表面熒光測量

用比對主導(dǎo)方提供的熒光彩虹校準(zhǔn)微球制作校準(zhǔn)曲線，測量結(jié)果見表2。由于流式細(xì)胞儀FC500的檢測器是根據(jù)熒光強(qiáng)度指數(shù)倍增，因此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)對熒光強(qiáng)度和測量熒光值選擇指數(shù)回歸，見圖7（a）。為了計(jì)算方便，將該曲線進(jìn)行對數(shù)變換，變成對熒光強(qiáng)度和測量熒光值的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸，見圖7（b）。

表2 熒光彩虹校準(zhǔn)微球的測量結(jié)果

圖7 熒光彩虹微球校準(zhǔn)曲線

比對樣品測量結(jié)果見表3，測量的熒光值Ec根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算等量熒光素?zé)晒庵礒。

CCQM公布的CD4＋抗原數(shù)測量結(jié)果（以熒光值E表示）為19 363，擴(kuò)展不確定度為15 916～22675（p＝95%）。中國計(jì)量科學(xué)研究院給出的測量結(jié)果是18372±2100（k＝2），接近中心值。

4 不確定度評定

本文分別對CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4表面抗原測量的不確定度進(jìn)行了評定［7～10］。

4.1 CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)不確定度評定

A類不確定度：CD4＋細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，根據(jù)貝塞爾公式

B類不確定度：根據(jù)第2.5節(jié)中的細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算式（1），B類不確定度有以下幾個來源：（1）CD4＋細(xì)胞檢測數(shù)P1

測量平均值P1＝12 699，廠家給出的測量重復(fù)性不大于2%，因此uB（P1）＝2%。

（2）顆粒檢測數(shù)P2

測量平均值P2＝10 000，廠家給出的測量重復(fù)性不大于2%，因此uB（P2）＝2%。

（3）校準(zhǔn)顆粒濃度

主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室NIST提供的校準(zhǔn)品濃度為51 511個／μL，但并未提供該標(biāo)物的不確定度，因此uB（B）＝0%。

（4）測量體積（移液器）

細(xì)胞溶液的體積200μL，根據(jù)移液器校準(zhǔn)證書uB（V1）＝1.5%，磷酸鹽緩沖液PBS的體積800 μL，根據(jù)移液器校準(zhǔn)證書uB（V2）＝1.0%。

因此總測量體積為1 000μL，uB（V）＝（200μL ×1.5%＋800μL×1.0%）／1000μL＝1.1%

（5）稀釋倍數(shù)

由于采用移液器稀釋，因此稀釋倍數(shù)的不確定度來源于移液器，稀釋倍數(shù)為1∶5的情況下，合并2次移液的不確定度為

合成B類不確定度為

相對合成不確定度為

擴(kuò)展不確定度為

因此，CD4＋細(xì)胞數(shù)為（320±28）個／μL（k＝2）。

表3 CD4＋表面抗原量（細(xì)胞表面等量熒光素值）

4.2 CD4抗原測量不確定度評定

A類不確定度：CD4＋表面抗原量（細(xì)胞表面等量熒光素值E）的測量結(jié)果見表3，平均CD4抗原值為18 372。根據(jù)貝塞爾公式

B類不確定度：

（1）校準(zhǔn)顆粒：校準(zhǔn)顆粒來自比對主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室NIST，未提供不確定度，因此ur1＝0%。

（2）熒光強(qiáng)度：廠家給出的測量重復(fù)性不大于2%，ur2＝2%。

（3）校準(zhǔn)曲線線性回歸引入的不確定度：在流式細(xì)胞儀中，熒光分子數(shù)x與測量的熒光信號強(qiáng)度y之間可以表示為

進(jìn)行對數(shù)變換得到

用x′表示lnx，y′表示lny，得到

評估式（4）線性擬合的不確定度［7］，其中殘差S為

式（4）中x′的不確定度為

根據(jù)式（6），計(jì)算u（x′）＝0.041

取擴(kuò)展因子k＝2，U（x′）＝0.041×2＝0.082則 9.728≤x′≤9.892

再進(jìn)行指數(shù)變換

假設(shè)x滿足t分布，

校準(zhǔn)曲線線性回歸引入的相對不確定度

合成B類不確定度

擴(kuò)展不確定度為U＝k×uc＝2×1050＝2100

每個細(xì)胞表面的CD4＋抗原數(shù)量（以E表示）為18372±2100（k＝2）。

5 結(jié) 論

在細(xì)胞表面熒光值的測量中，第一次測量是直接采用熒光測量值與熒光分子數(shù)的線性回歸，得到的CD4表面抗原數(shù)量（E）明顯偏低。通過考察該流式細(xì)胞儀器的熒光檢測器相應(yīng)方式，發(fā)現(xiàn)其檢測器是指數(shù)倍增，因此改用熒光測量值與熒光分子數(shù)分別取對數(shù)后再進(jìn)行線性回歸，所得的測量結(jié)果接近國際比對平均值。

通過CCQM-P102具有特定表型的細(xì)胞測量比對，中國計(jì)量科學(xué)研究院驗(yàn)證了實(shí)際測量能力，得到較好的測量結(jié)果，參加比對的15個實(shí)驗(yàn)室中，僅3家實(shí)驗(yàn)室（包括中國NIM，英國NIBSC，美國NIST）提供了測量不確定度評定，進(jìn)行了流式細(xì)胞技術(shù)測量不確定度的探索性研究。這些可為今后研制外周血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將比對成果應(yīng)用到量值溯源中，更好地促進(jìn)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化提供經(jīng)驗(yàn)。

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Research on CCQM-P102 Quantification of Cells with
Specific Phenotype and Uncertainty Evaluation in Flow Cytometry

ZHANG Ling1， WANG Jing1， CHEN Da-zhou1， SUIZhi-wei1， LIU Xin-hai2
（1.National Institute ofMetrology，Beijing 100013，China；
2.Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Science，Beijing100022，China）

National Institute of Metrology（NIM）was invited to participate in CCQM-P102 comparison“cells with specific phenotype quantitativemeasurement”in 2010.The results showed that，CD4＋cell countmeasurements in NIM achieved equivalent consistent with the participating countries and got good results.Mean CD4 antigens per cell by fluorescence intensity values was measured by linear regression after logarithmic transformation，the value got in the uncertainties of the international comparisonm，and submitted flow cytometrymeasurement uncertainty assessment to CCQM as one of the three laboratories（NIM，China；NIBSC，UK and NIST U.S.），which was discussed.

Metrology；Flow cytometry；CD4＋cell count；International comparison；Uncertainty

TB99

A

1000-1158（2014）01-0092-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．01．19

2012-06-18；

2013-10-29

國家科技支撐項(xiàng)目（2008BAK41B03，2013BAK12B05）；中國計(jì)量科學(xué)院基本業(yè)務(wù)費(fèi)科研課題（AKY0915）

張玲（1980－），女，山東濟(jì)南人，中國計(jì)量科學(xué)研究院助理研究員，主要從事生物化學(xué)和微生物計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。zhangling＠nim.ac.cn劉新海為通訊作者。drlxh＠126.com