轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)同實(shí)驗(yàn)研究

董蓮華， 李 亮， 周云龍， 曹應(yīng)龍，沈 平， 盧長(zhǎng)明， 王 晶， 劉張嵐

（1.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013； 2.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)同實(shí)驗(yàn)研究

董蓮華1， 李 亮1， 周云龍2， 曹應(yīng)龍3，沈 平2， 盧長(zhǎng)明3， 王 晶1， 劉張嵐1

（1.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013； 2.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性熒光定量PCR方法的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，選擇了7家實(shí)驗(yàn)室采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法對(duì)3個(gè)水平的轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)比較分析各參與實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的參數(shù)，進(jìn)一步證明該方法室間重復(fù)性好。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各參與實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)等精度，因此計(jì)算各實(shí)驗(yàn)室的總平均值做為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值。3個(gè)水平的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值和擴(kuò)展不確定度（k＝2）分別為1.17%±0.22%、2.17%±0.38%和9.81%±2.30%。

計(jì)量學(xué)；轉(zhuǎn)基因玉米；T25；基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1 前 言

轉(zhuǎn)基因玉米在全球范圍的大面積種植，使其食用安全和環(huán)境安全問(wèn)題引起了各國(guó)政府和相關(guān)國(guó)際組織的高度重視，各國(guó)紛紛出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因生物安全管理相應(yīng)的法規(guī)，這對(duì)轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了挑戰(zhàn)。目前我國(guó)農(nóng)業(yè)部已頒布了轉(zhuǎn)基因玉米定性PCR檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，然而尚缺乏轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而無(wú)法保證轉(zhuǎn)基因檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠和可比性，因此加快轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制勢(shì)在必行。

轉(zhuǎn)基因玉米T25為拜耳公司生產(chǎn)的具有草丁膦抗性的轉(zhuǎn)基因玉米，該品種中Camv35s啟動(dòng)子與nos終止子一同控制草丁膦抗性基因PAT。PAT是來(lái)源于桿菌Bacillus amyloliquefaciens草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，它能使草丁膦中游離氨基乙?；Щ?。PAT與已知的120多種人體蛋白無(wú)同源性。目前，美國(guó)、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國(guó)家已批準(zhǔn)該轉(zhuǎn)基因玉米在飼料中使用。為了加強(qiáng)對(duì)該轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)，美國(guó)油料化學(xué)學(xué)會(huì)（AOCS）已經(jīng)研制了該玉米的葉片基因組DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［1］。目前對(duì)于生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，尤其是轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可參考的定值方法較少，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是目前可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)比較成熟的方法［2～4］，本文選擇多家協(xié)同定值方式對(duì)研制的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行協(xié)同研制，并且使用的定值方法（轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性和玉米內(nèi)標(biāo)基因特異性定量PCR方法）是經(jīng)過(guò)歐盟確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法［5］，但在使用該方法定值前本文先對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證［6］，然后選擇6～8家實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)研制的轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合定值。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 轉(zhuǎn)基因玉米T25陽(yáng)性和陰性材料

轉(zhuǎn)基因玉米T25陽(yáng)性和陰性材料由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供；轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個(gè)含量水平基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制；轉(zhuǎn)基因玉米T25陽(yáng)性基因組DNA，購(gòu)自美國(guó)油料化學(xué)會(huì)（AOCS）標(biāo)準(zhǔn)值（轉(zhuǎn)基因質(zhì)量比）大于999.9 ng／μg，不確定度可以忽略（詳見(jiàn)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)）。

2.1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、購(gòu)自天根生化科技有限公司，定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI北京分公司。

2.1.3 特異性引物和探針

本實(shí)驗(yàn)所使用的引物探針均由上海英俊公司合成。其中探針5’端采用熒光標(biāo)記基團(tuán)FAM進(jìn)行標(biāo)記，3’端采用熒光淬滅基團(tuán)TAMRA進(jìn)行標(biāo)記。具體序列參考?xì)W盟公開(kāi)發(fā)布的轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性方法驗(yàn)證報(bào)告［5］，見(jiàn)表1。

表1 Taqman探針實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)引物和探針序列信息

2.2 方法

2.2.1 樣品DNA的提取

采用天根生化科技公司的植物DNA抽提試劑盒（離心柱型）對(duì)樣品的基因組DNA進(jìn)行提取，具體過(guò)程見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.2.2 紫外分光光度法檢測(cè)提取DNA純度

用1×TE0.1做空白采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定A260、A280和A320的紫外吸收值，然后將提取的DNA溶液分別測(cè)定A260、A280和A320下的紫外吸收值。以A320作為背景吸收計(jì)算出樣品DNA溶液在260 nm、280 nm處的紫外吸收值。

2.2.3 熒光染料法測(cè)定DNA濃度

為能準(zhǔn)確測(cè)定DNA的濃度，本實(shí)驗(yàn)采用熒光染料法，即PicoGreen dsDNA定量試劑盒法測(cè)定提取DNA溶液的濃度。實(shí)驗(yàn)中使用的熒光染料P7589能特異性的結(jié)合雙鏈DNA，因此可以特異性測(cè)定雙鏈DNA的濃度，受單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)的影響較小。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

經(jīng)過(guò)純度鑒定后提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所用的引物探針及濃度見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，50個(gè)循環(huán)。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用熒光染料法測(cè)定濃度，計(jì)算溶液中含有的基因組的拷貝數(shù)，然后采用梯度稀釋法對(duì)基因組DNA溶液進(jìn)行稀釋。分別稀釋5個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5μL已稀釋的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文第2.2.4節(jié)中描述的熒光定量PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后得到以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

式中，［DNA］為測(cè)定的基因組溶液的質(zhì)量濃度，g／L；MW為基因組的分子量大小，其中基因組大?。▔A基對(duì)）為2 500×106。

定量PCR的擴(kuò)增效率計(jì)算式為

E為擴(kuò)增效率；ks為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法驗(yàn)證

3.1.1 樣品DNA的質(zhì)量檢查

根據(jù)OD260／OD280的比值，確定提取DNA的純度，當(dāng)比值為1.8～2.0之間說(shuō)明樣品DNA質(zhì)量滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。轉(zhuǎn)基因玉米T25標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品提取DNAA260／A280比值均處在1.8～2.0之間，見(jiàn)表2，表明提取的DNA質(zhì)量純度符合要求。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米T25基因組DNA質(zhì)量分析（n＝5）

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)

對(duì)其線(xiàn)性擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率必須在－2.9～－3.7，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)＞0.985，見(jiàn)表3，因此斜率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均滿(mǎn)足要求［7］。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米T25內(nèi)、外標(biāo)準(zhǔn)基因定量PCR擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)

3.1.3 重復(fù)性

在對(duì)建立的轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR檢測(cè)方法內(nèi)、外標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增效率，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證后，用建立的定量PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25基體A、B、C 3個(gè)梯度水平的樣品進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，所有樣品定量分析的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在25%之內(nèi)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR方法的重復(fù)性能夠滿(mǎn)足定量的要求［7］，可用于該基體物質(zhì)的定值。

表4 轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR檢測(cè)重復(fù)性（n＝9）

3.2 協(xié)同實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

上述方法經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證可用于轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，選擇有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室使用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。每個(gè)參與協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)3個(gè)待測(cè)定樣品進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，每次重復(fù)測(cè)定至少設(shè)置3個(gè)平行。

此次協(xié)同實(shí)驗(yàn)中選擇了7家實(shí)驗(yàn)室，7家實(shí)驗(yàn)室使用了不同的定量PCR儀器、不同的儀器分析軟件以及不同的基線(xiàn)設(shè)定方法。實(shí)驗(yàn)室使用的定量PCR儀器主要是ABI系列，Rotor-Gene 3000A和bio-rad系列定量PCR儀?；€(xiàn)和閾值的設(shè)置除1家實(shí)驗(yàn)室外，其余6家均采用自動(dòng)設(shè)置。從各實(shí)驗(yàn)室定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)可以看出，不同的PCR儀器均得到了較好的擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR體系適用于不同的PCR儀器，具有較好的穩(wěn)定性。

各實(shí)驗(yàn)室定量PCR的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率以及定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5，由表中結(jié)果可以看出，7個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增效率在0.87～0.96之間，平均值為0.93，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。外標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增效率在0.83～0.93之間，平均值為0.89，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。說(shuō)明各家實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)符合定量要求，具有較好的擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)。

表5 各實(shí)驗(yàn)室定量PCR的擴(kuò)增效率和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值

根據(jù)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制規(guī)范［8］中對(duì)采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值時(shí)數(shù)據(jù)處理要求，首先考察各實(shí)驗(yàn)室全部測(cè)量數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，3個(gè)水平的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果均服從正態(tài)分布。然后將各實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的平均值視為一組新的數(shù)據(jù)，再對(duì)各家平均值采用格拉布斯準(zhǔn)則進(jìn)行離群值檢驗(yàn)［9］，經(jīng)檢驗(yàn)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)離群值。最后用科克倫（Cochran）法檢查各組數(shù)據(jù)之間是否等精度［10］，經(jīng)檢驗(yàn)各家數(shù)據(jù)等精度，因此計(jì)算其總平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，所得算術(shù)平均值即為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值，見(jiàn)表6。

表6 多家協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 不確定度評(píng)定

轉(zhuǎn)基因玉米T25定值結(jié)果的不確定度由兩部分組成，第一部分是定值結(jié)果的A類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA，第二部分是定值方法的B類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB。

A類(lèi)不確定度uA是通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出的不確定度。通過(guò)分析，各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)平均值等精度，因此A類(lèi)不確定度的具體計(jì)算方法為：

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由m個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定平均值為測(cè)定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，間等精度為

B類(lèi)不確定的主要來(lái)源包括：（1）移液器帶來(lái)的不確定度；（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液系列稀釋帶來(lái)的不確定度；（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。由標(biāo)物證書(shū)可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度可以忽略，因此B類(lèi)不確定評(píng)定僅考慮前2個(gè)因素。

表7 轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度（%）

4 總 結(jié)

對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR方法進(jìn)行了方法驗(yàn)證研究，測(cè)試了定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性相關(guān)性、PCR擴(kuò)增效率、重復(fù)性等主要技術(shù)參數(shù)，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該方法滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值要求。組織了7家實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個(gè)水平的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了協(xié)同定值，對(duì)多家定值的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)分析得出，轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個(gè)水平的轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.99%、1.61%和10.38%，擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度（K＝2）分別為0.22%、0.38%和2.3%。

［1］ AOCS0306-H3＋Certificate［EB］.https：／／secure.aocs. org／crm／files／0306H3-Certificate.pd f，2011-08-05.

［2］ R?nning SB，Va?tilingom M，Berdal K G，etal.Event specific real-time quantitative PCR for genetically modified Bt11 maize（Zea mays）［J］.EuropeanFood ResearchTechnology，2003，216（4）：347－354.

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［8］ JJG 1006—94，一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［S］.

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［10］ JJF 1343—2012，General and statistical principles for characterization of referencematerials［S］.

Characterizing on Genetically Modified T25 Maize Line Matrix Reference Material

DONG Lian-hua1， LILiang1， ZHOU Yun-long2， CAO Ying-Long3，SHEN Ping2， LU Chang-ming3， WANG Jing1， LIU Zhang-lan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing100013，China；
2.Science and Technology Development Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100122，China；
3.Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Wuhan，Hubei430062，China）

To validate the key parameters of the real time PCR method for GM maize T25，7 different laboratories are chosen to assign the reference values of three different GM content matrix reference materials by using the same method.Although different types of instruments are used by different labs，the standard curve generated by each lab is comparable which indicated that thismethod shows a good reproductablity.After statistically analyzing the data gained from seven labs，the totalmeans are assigned to be the reference values.The reference values and expanded uncertainties（k＝2）for threematrix GM referencematerial are 1.17%±0.22%，2.17%±0.38%and 9.81%±2.30%.

Metrology；Geneticallymodified maize；T25；Matrix referencematerial；Real time quantitative PCR

TB99

A

1000-1158（2014）01-0087-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．01．18

2011-09-05；

2013-05-20

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2008ZX08012-003）；科技支撐項(xiàng)目（2008BAK41B01）

董蓮華（1981－），河北淶水，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院助理研究員，博士，主要從事微生物轉(zhuǎn)基因核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究。lianhuadong＠gmail.com