復方丹參片中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量測定

王蒙蒙,馮素香,李曉玉,周悌強,白 燕,吳兆宇

(河南中醫(yī)學院藥學系,河南鄭州45000)

復方丹參片中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量測定

王蒙蒙,馮素香*,李曉玉,周悌強,白 燕,吳兆宇

(河南中醫(yī)學院藥學系,河南鄭州45000)

目的 建立復方丹參片中丹參酮ⅡA及丹酚酸B的高效液相色譜測定方法。方法 色譜柱為Venusil XBP C18(L)(4.6 mm×250 mm,5μm),丹酚酸B的流動相為:乙腈∶甲醇∶甲酸∶水(10∶30∶1∶59),檢測波長為286 nm;丹參酮IIA的流動相為:甲醇∶水(85∶15),檢測波長為270 nm。以外標法進行定量計算。結果丹參酮IIA和丹酚酸B分別在0.036 8～0.736μg和0.06～1.20μg范圍內線性良好,平均加樣回收率和RSD分別為98.41%、1.28%(n=9);98.29%、1.21%(n=9)。結論 該方法簡便、準確、靈敏度高,重復性好,無干擾,可用于復方丹參片的質量評價及丹參制劑的質量控制。

復方丹參片;丹酚酸B;丹參酮IIA;高效液相色譜法

復方丹參片由丹參、三七和冰片組成,具有活血化瘀、理氣鎮(zhèn)痛作用,用于氣滯血瘀所致的胸痹癥、胸悶、冠心病心絞痛等治療[1]。丹參的化學成分主要分脂溶性和水溶性兩大類,其中脂溶性成分主要有丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等,該類化合物有較強的抗心肌缺血、抗菌、抗雄性激素的生理活性。丹參中的水溶性成分主要有:丹參素、原兒茶醛、和丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等,是丹參治療冠心病的主要有效成分[2]。為提升復方丹參片的質量控制標準,保證制劑有效成分含量的穩(wěn)定性和可靠性,對丹參片的質量標準進行了一系列規(guī)范研究,建立了采用高效液相色譜法測定復方丹參片中丹參酮ⅡA及丹酚酸B含量的方法,對有關丹參制劑質量標準的提升起到積極的促進作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(2695高效液相泵, 2998紫外檢測器,Empower 2工作站;美國waters公司);KH-2200DB型數控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);Sarterius BS 224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);SHZ-D (Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 (鞏義市予華儀器有限責任公司);HH-6型數控恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司);EYELA N-1100旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

1.2 試藥

復方丹參片(批號:20120318;20120319; 20120320廣州白云山和記黃埔中藥有限公司);丹酚酸B(批號:111562-200605);丹參酮IIA(批號: 110766-200619)均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈(HPLC級,Grace Company INC);甲醇(分析純,天津四友精細化學品有限公司);甲酸(分析純,天津鷗博凱化工有限公司);其他試劑均為分析純,水為超純水。

2 方法與結果

2.2 丹參酮ⅡA含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)(博納艾杰爾科技有限公司),柱溫:25℃;流動相:甲醇-水(85∶15);檢測波長為270 nm。理論塔板數按丹參酮ⅡA峰計算應不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取丹參酮IIA對照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每m L含40μg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片,精密稱定,研細,取約1 g,精密稱定,置具塞棕色瓶中,精密加入甲醇25 m L,密塞,稱定重量,超聲處理15 min(250 W,33 k Hz),放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,置棕色瓶中。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方量并以相同的工藝分別制備不含丹參陰性對照樣品,照上述供試品溶液制備方法處理,得陰性對照溶液。

偉大的丟番圖一生的六分之一是幸福的童年，24年后，他有了孩子，可惜的是，他的孩子只活了父親壽命的一半。丟番圖把喪子之痛轉化為研究數學的動力，就這樣又過了4年，他壽終正寢。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各10μL,注入液相色譜儀進行測定。結果陰性對照色譜中,在與對照品及供試品色譜圖對應保留時間處無相應色譜峰,表明其他組份對測定丹參酮IIA無干擾,結果見圖1。

圖1 丹參酮IIA HPLC色譜圖A對照品(1丹參酮)IIA B供試品(1丹參酮IIA) C缺丹參陰性

2.2.6 線性關系考察 按以上色譜條件,分別用自動進樣器進1、2、4、6、10、20μL的上述對照品溶液,記錄色譜圖。以濃度為橫坐標,相應的峰面積為縱坐標,得線性回歸方程Y=2.1E+5x-27 024,r2= 0.999 5.結果表明,丹參酮ⅡA進樣量在0.036 8～0.736μg范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 取同一對照品溶液,連續(xù)進樣5次,每次10μL,記錄丹參酮IIA峰面積,計算精密度的RSD為1.5%。表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取復方丹參片樣品5份,按2.2.2項方法制得供試液并按上述色譜條件測定丹參酮IIA的含量,計算RSD值為2.6%,表明重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量(丹參酮IIA約0.170 0 mg/g)的復方丹參片約0.5 g,共9份,精密稱定,分為3組,每組分別加入質量濃度為0.167 5 mg/m L的丹參酮IIA對照品0.8、1.0、1.2 m L,照上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定,結果顯示丹參酮IIA的加樣回收率的RSD為1.28%,見表1。

表1 丹參酮IIA回收率實驗結果(n=9)

由表可知,該方法測得的加樣回收率平均值為98.41%,回收率的RSD≤3%,可知用該方法測試結果符合定量分析要求。

2.3 丹酚酸B含量測定2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)(博納艾杰爾科技有限公司),柱溫:25℃;流動相:甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59);流速∶1 m L/min;檢測波長:286 nm。理論塔板數按丹酚酸B峰計算應不低于4 000。2.3.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品適量,精密稱定,加水制成每1 m L含60μg的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品10片,精密稱定,研細,取約0.15 g,精密稱定,置50 m L量瓶中,加水適量,超聲處理(300 W,50 k Hz)30 min,放冷,加水至刻度,搖勻,離心,取上清液。

2.3.5 專屬性試驗 精密吸取丹酚酸B對照品、供試品及陰性對照溶液各10μL,注入液相色譜儀進行測定。結果陰性對照色譜中,在與對照品及供試品色譜圖對應保留時間處無相應色譜峰,表明其他組份對測定丹酚酸B無干擾,見圖2。

圖2 丹酚酸B HPLC色譜圖A對照品(1丹酚酸B) B供試品(1丹酚酸B) C缺丹參陰性

2.3.6 線性關系 按以上色譜條件,分別用自動進樣器進1、2、4、6、8、10、20μL的上述對照品溶液,記錄色譜圖,以濃度為橫坐標,相應的峰面積為縱坐標,得線性回歸方程Y=281 71x-1 031.9,r2= 0.999 6。結果表明,丹酚酸B進樣量在0.06～1.20μg范圍內線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取同一對照品溶液,連續(xù)進樣5次,每次10μL,記錄丹酚酸B峰面積,計算RSD為1.3%,表明儀器的精密度良好。

2.3.8 重復性試驗 取復方丹參片樣品5份,按2.3.2項方法制得供試液并按上述色譜條件測定丹酚酸B的含量,計算RSD值,樣品的RSD為1.8%,重復性較好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含有量(丹酚酸B約8.840 mg/g)的復方丹參片約0.075 g,共9份,精密稱定,分為3組,每組分別加入質量濃度為8.755 mg/m L的丹酚酸B對照品0.8、1.0、1.2 mL,照上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定,結果顯示的丹酚酸B加樣回收率的RSD為1.21%。見表2。

由表可知,該方法測得的加樣回收率平均值為98.29%,回收率的RSD≤3%,可知用該方法測試結果符合定量分析要求。

表2 丹酚酸B回收率實驗結果(n=9)

2.4 樣品的測定

取3批復方丹參片樣品(20120318,20120319, 20120320),每批取6份,照2.2.1及2.3.1項下供試品溶液制備方法制備,2.2.3及2.3.3項下HPLC色譜條件測定,記錄色譜峰面積并計算,測定結果見表3。

表3 復方丹參片樣品含量測定結果

3 討論

復方丹參片為中藥復方制劑,片劑含量測定時供試品溶液制備方法主要有超聲、回流[3]。該實驗對這兩種提取方法進行了比較,超聲提取丹參酮IIA和丹酚酸B的平均質量分數分別為1.112 mg/g、54.05 mg/g,RSD分別為2.35%、1.63%;回流提取丹參酮IIA和丹酚酸B的平均質量分數分別為1.243 mg/g、54.15 mg/g。RSD分別為2.06%、1.83%。結果表明,采用超聲和回流方法提取含有量相近,無顯著性差異。超聲提取操作簡便,因此選擇超聲處理作為供試品溶液的制備方法。

復方丹參片由于療效顯著價格低廉,被廣泛運用于臨床[4]。我們通過HPLC方法對復方丹參片樣品中的丹酚酸B和丹參酮IIA進行含量測定,更全面、科學、合理地對丹參提取物進行質量評價和控制,有利于保證產品質量及臨床療效。建立了復方丹參片中丹酚酸B和丹參酮IIA的含量測定方法,該法靈敏度高、專屬性強、重現(xiàn)性好,可作為復方丹參片的質量控制手段。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:904-905.

[2]王麗萍.高效液相色譜法測定復方丹參片中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量[J].醫(yī)藥導報,2007,10(26):1 215-1 216.

[3]鄭琴,胡鵬翼,楊明,等.丹參制劑中丹參不同提取方法的合理性評價[J].中國藥房,2011,22(35):3 293-3 295.

[4]秦健,吳孟嵐.復方丹參片質量分析[J].中國藥事,2006, 20(12):746-749.

[責任編輯 李武營]

Determination of the content of Compound Salvia Tablet salvianolic acid B and tanshinone IIA

WANG Mengmeng，F(xiàn)ENG Suxiang*，LI Xiaoyu，ZHOU Diqiang，BAI Yan，WU Zhaoyu
（Henan University fo tradtional Chinese Medicine Deparement of Pharmacy，Zhengzhou，Henan 450000，China）

Objective Establish a determination of the content of Compound Salvia Tablet salvianolic acid B and tanshinone IIA by High performance liquid chromatography.Methods The column was Venusil C18（L）（4.6 mm ×50 mm，5μm），mobile phase of the Salvianolic acid B was Acetonitrile Methanol formic acid water（10∶30∶1∶59），the detective wavelength at 286nm.mobile phase of the tanshinone IIA was Methanol water（85∶15）and the detective wavelength at 270 nm，both of the injection volume were 10μL.Outside the standard method for quantitative calculation.Results Tanshinone IIA and salvianolic acid B in 0.036 8-0.736μg and 0.06-1.20μg good linearity in the range，The average recovery and RSD were 98.41%，1.28%（n=9）；98，29%，1.21%（n= 9）.Conclusion The experimental method has the characteristics of fast and effective sample pretreatment and short of Sample analysis time The method is simple，accurate，high sensitivity，good repeatability and no interference. Can be used for control the quality of Compound Salvia Tablet and Salvia miltiorrhiza preparation.

Compound Salvia Tablet；acid B；tanshinone IIA；HPLC

R927.2

A

1672-7606(2014)02-0108-05

2014-03-12

王蒙蒙(1990-),女,河南鄭州人,碩士研究生,從事中藥質量分析與新藥研究工作。

*通訊作者:馮素香(1971-),女,河南鄭州人,博士,碩士生導師,副教授,從事中藥質量分析與新藥研究工作。