旋毛蟲的低溫耐受性和感染性的實驗研究

秦嘯鳴,宋 輝,傅 皓,張 軍,王國英,白慧玲*

(1.河南大學醫(yī)學院,河南開封475004;2.河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學實驗室,河南開封475004)

旋毛蟲的低溫耐受性和感染性的實驗研究

秦嘯鳴1,宋 輝1,傅 皓1,張 軍2,王國英2,白慧玲2*

(1.河南大學醫(yī)學院,河南開封475004;2.河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學實驗室,河南開封475004)

目的 觀察旋毛蟲的低溫耐受性和感染性。方法 20只雌性昆明小鼠被隨機分為對照組和實驗組,實驗組根據(jù)溫度不同分3組,共4組,每組5只。對照組每鼠經(jīng)口感染150條肌幼蟲。實驗組①組(低溫1 h組):肉樣置于-18℃、1 h;②組(低溫4 h組):肉樣置于-18℃、4 h;③組(低溫24 h組):肉樣置于-18℃、24 h;經(jīng)低溫處理的3組鼠肉取出后,室溫下(16℃)徹底融化,磁力攪拌法(消化2 h)收集幼蟲。然后分別人工灌胃小鼠,每鼠經(jīng)口感染150條肌幼蟲。所有小鼠感染后28 d剖殺,取膈肌壓片鏡檢,并用磁力攪拌法收集肌幼蟲、計數(shù)。結(jié)果 對照組、低溫1 h組、低溫4 h組和低溫24 h組的肌幼蟲均數(shù)分別為:5 490.40、2 397.60、319.60、0;低溫1 h組和低溫4 h組2組的肌幼蟲均數(shù)顯著低于對照組(P＜0.01);低溫4 h組的肌幼蟲均數(shù)低于低溫1 h組(P＜0.05)。結(jié)論低溫(18℃)對旋毛蟲具有殺傷作用,旋毛蟲囊內(nèi)幼蟲的活力和感染性與冷凍時間和肉樣厚度均有直接關系。

旋毛蟲;低溫耐受;感染性;小鼠

旋毛蟲病是一種動物源性寄生蟲病,目前已知豬、野豬、狗、鼠等150多種動物自然感染有旋毛蟲。旋毛蟲(Trichinella spiralis)的成蟲和幼蟲寄生于同一宿主,成蟲主要寄生在宿主的十二指腸和空腸上段,幼蟲寄生在橫紋肌細胞內(nèi),在肌肉內(nèi)形成具有感染性的幼蟲囊包。豬是人體旋毛蟲病的主要傳染源。旋毛蟲病不僅嚴重危害人體健康,對養(yǎng)豬業(yè)也可造成巨大的經(jīng)濟損失。食用豬肉的無害化處理能降低感染風險,減少感染機會;只有消滅傳染源,切斷傳播途徑,才能保護易感人群。我們的實驗通過對旋毛蟲的低溫耐受性和感染性之間關系的研究,為食用豬肉的無害化處理提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲蟲種

引自河南省疾病預防控制中心,用小白鼠傳代保種的旋毛蟲;實驗前以肌幼蟲轉(zhuǎn)種小白鼠備用。每鼠經(jīng)口感染150條肌幼蟲。

1.2 實驗方法

35日齡雌性昆明小鼠,體質(zhì)量18～22 g,購自鄭州大學實驗動物中心。20只小鼠被隨機分為對照組和實驗組,實驗組分為3組,共4組,每組5只。

1.2.1 對照組 將感染旋毛蟲肌幼蟲30 d后的小鼠引頸處死,磁力攪拌法(消化2 h)收集幼蟲。每鼠經(jīng)口感染150條肌幼蟲。

1.2.2 實驗組 感染旋毛蟲肌幼蟲30 d后的小鼠引頸處死,小鼠肉剪碎,將肉樣置不銹鋼槽,鋼槽體積為20 mm×20 mm×20 mm。低溫1 h組:肉樣置于-18℃、1 h;低溫4 h組:肉樣置于-18℃、4 h;低溫24 h組:肉樣置于-18℃、24 h。經(jīng)低溫處理的3組鼠肉取出后,室溫下(16℃)徹底融化,磁力攪拌法(消化2 h)收集肌幼蟲。然后分別人工灌胃小鼠,每鼠經(jīng)口感染150條肌幼蟲。

1.3 肌幼蟲檢查

所有小鼠感染后28 d處死,取膈肌壓片鏡檢,并將全部肌肉人工消化后計數(shù)肌幼蟲數(shù)。取小鼠全部肌肉(去皮、頭尾、4爪及內(nèi)臟),剪碎后加入人工消化液(胃蛋白酶1 g,鹽酸1 m L,蒸餾水99 m L),置于恒溫磁力攪拌器上,37℃攪拌2 h,待肌肉完全消化后經(jīng)過濾、自然沉淀,無菌生理鹽水漂洗3～4次,收集肌幼蟲并計數(shù),計算減蟲率。減蟲率=(對照組肌幼蟲平均數(shù)-實驗組肌幼蟲平均數(shù))/對照組肌幼蟲平均數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膈肌壓片鏡檢

對照組小鼠感染28 d后,膈肌壓片鏡檢,均檢出肌幼蟲,檢出率為100%。實驗組小鼠感染28 d后,低溫1 h組和低溫4 h組2組小鼠膈肌壓片鏡檢,均檢出肌幼蟲,檢出率為100%;低溫24 h組,小鼠膈肌壓片鏡檢,均未檢出肌幼蟲。

2.2 人工消化全部肌肉鏡檢

對照組小鼠感染28 d后,小鼠取全部肌肉,人工消化后鏡檢,均檢出肌幼蟲,檢出率為100%。實驗組小鼠感染28 d后,低溫1 h組和低溫4 h組2組小鼠取全部肌肉,人工消化后鏡檢,均檢出肌幼蟲,檢出率為100%;低溫24 h組小鼠取全部肌肉,人工消化后鏡檢,均未檢出肌幼蟲。低溫1 h組、低溫4 h組與對照組的肌幼蟲均數(shù)差異均有非常顯著性(q對照與1h=5.63,q對照與4h=9.42,P＜0.01);低溫1 h組與低溫4 h組的幼蟲均數(shù)差異有顯著性(q1h與4h= 3.78,P＜0.05)。見表1。

表1 感染28 d后各組小鼠肌幼蟲檢查結(jié)果(±s,n=5)

表1 感染28 d后各組小鼠肌幼蟲檢查結(jié)果(±s,n=5)

注:與對照組相比,*P＜0.01。

組別 感染蟲數(shù)/條 檢獲肌幼蟲數(shù)/條 減蟲率/%對照組 150 5 490.40±1 771.76 0實驗組低溫1 h組 150 2 397.60±1 168.27*56.33低溫4 h組 150 319.60±144.28*94.18低溫24 h組 150 0 100.00

3 討論

根據(jù)生物學和生物化學研究,尤其是基因分類學研究,將旋毛形線蟲屬分為8個種:即旋毛蟲(T. spiralis)、北方旋毛蟲(T.nativa)或鄉(xiāng)土旋毛蟲、布氏旋毛蟲(T.britovi)、 偽旋毛蟲(T.pseudospiralis)、米氏旋毛蟲(T.murrelli)、南方旋毛蟲(T.nelsoni)或納氏旋毛蟲、巴布亞旋毛蟲(T. papuae)及津巴布韋旋毛蟲(T.zimbabwensis),以及3個分類地位尚未確定的基因型,即Trichinella T6、T8和T9;我國已發(fā)現(xiàn)的旋毛蟲有2種,即旋毛蟲和鄉(xiāng)土旋毛蟲[1]。國內(nèi)學者研究[2-6]證明,中國豬旋毛蟲為T.spiralis,中國犬旋毛蟲為T.nativa。

豬肉仍是我國人體旋毛蟲病爆發(fā)的主要感染源[7]。人體感染旋毛蟲病主要是由于食入了含有旋毛蟲活幼蟲囊包的肉類及其制品。幼蟲囊包的抵抗力強,熏烤、腌制和暴曬等方式也不能殺死幼蟲[8]。張璽等[9]的研究顯示,用食用醋或醬油腌制肉類制品(腌肉、香腸和酸肉等),雖有可能降低旋毛蟲肌幼蟲的感染性和生殖力,但其效果可能受腌制時間長短、肉塊大小等多種因素的影響,所以在實際應用中食用醋或醬油對旋毛蟲肌幼蟲的殺傷效果較難進行評價。0℃和20℃條件下,旋毛蟲肌幼蟲在干燥和生理鹽水環(huán)境中能夠生存長達10 d以上,并具有感染新宿主的能力[10]。感染旋毛蟲的豬肉即使經(jīng)過50～60 Mpa高壓仍不能將肌幼蟲全部殺滅[11]。

國際旋毛蟲病委員會認可的3種能確保肉類安全的加工方法包括冷凍、放射及烹飪[12]。宋銘忻等[13]的實驗結(jié)果顯示,T.spiralis在豬體內(nèi)-32℃、24 h,-22℃、72 h,在小鼠體內(nèi)-32℃、12 h全部死亡,認為-30℃是一個關鍵溫度,在此溫度下,旋毛蟲僅能存活短暫的時間。我們的實驗結(jié)果顯示,在-18℃條件下,當肉樣厚度為20 mm時,經(jīng)過1 h和4 h冷凍,在小鼠體內(nèi),低溫1 h組的減蟲率為56.33%,低溫4 h組的減蟲率為94.18%,囊內(nèi)幼蟲部分仍然有活力,具有感染性;但低溫4 h組的肌幼蟲均數(shù)顯著低于低溫1 h組,2組的肌幼蟲均數(shù)又均顯著低于對照組;經(jīng)過24 h冷凍,低溫24 h組的減蟲率為100%,囊內(nèi)幼蟲均失活,感染性全部喪失。

上述結(jié)果說明,低溫冷凍(-18℃)對旋毛蟲具有殺傷作用,囊內(nèi)幼蟲隨著冷凍時間的延長,活力減弱,感染性逐漸下降。但其死亡時間與囊包所在肉樣的位置有關,位于肉樣邊緣部位的囊包,能在較短時間內(nèi)被凍透,即可導致囊內(nèi)幼蟲死亡;位于肉樣中心部位的囊包,在一定時間內(nèi)未被凍透,囊內(nèi)幼蟲未受到致死的影響,幼蟲得以存活,其活力和感染性依舊保持。因此,囊內(nèi)幼蟲的活力和感染性與冷凍時間和肉樣厚度均有直接關系。低溫冷凍-18℃,旋毛蟲的感染性能夠得到控制,但是要保證食用肉品的安全,冷凍肉塊的厚度和冷凍時間之間的關系和影響還需要進一步探討和研究。

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[責任編輯 姬 荷]

Studies on the infectivity and freeze resistance of Trichinella spiralis in mice

QIN Xiaoming1，SONG Hui1，F(xiàn)U Hao1，ZHANG Jun2，WANG Guoying2，BAI Huiling2*
（1.Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Laboratory of Cellular and Molecular Immunology，Medical College，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To observe the infectivity and freeze resistance of Trichinella spiralis.Methods Twenty female Kunming mice were randomly divided into one control group and three test groups，so 4 groups（with 5 mice per group）in total.For the control group each mouse was inoculated orally with 150 muscle larvae of T.spiralis. Test Group one's samples were stored at-18℃for 1h；test group two's samples were stored at-18℃for 4 h；test group three's samples were stored at-18℃for 24 h.All samples were taken out and thawed；muscle larvae of T.spiralis were collected by the magnetic stirrer method.Then，each mouse was orally inoculated with 150 disposed muscle larval of T.spiralis.All infected mice were sacrificed on the 28 th day after infectio，and muscle larval of T.spiralis were examined respectively by diaphragma compression method and digestion method for all infected mice.Results The average number of muscle larvae stored at-18℃for 1h and 4h were 2 397.60 and 319.60，respectively.These two groups'averages were obviously lower than that of the muscle larvae control group（P＜0.01）.Group two（4 h）'s averages were lower than that of the group one（1 h）（P＜0.05）.Conclusion Freezing does the vital harm to the muscle larval of T.spiralis.The activity and infectivity of muscle larvae are dependent on both freezing periods and muscle depth.

Trichinella spiralis；freeze resistance；infectivity；mice

R383.1

A

1672-7606(2014)02-0091-03

2014-02-15

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201210475067);河南大學校級教學改革項目(HDXJJG2013-138)。

秦嘯鳴(1993-),男,河南開封人,本科在讀生。

*通訊作者:白慧玲(1964-),女,河南尉氏人,教授,碩士生導師,從事免疫學的教學及科研工作。