升降二丹抗腫瘤作用的研究

李 紅,戚笑笑,李依芃,杜鋼軍*

(1.河南大學藥學院藥物研究所,河南開封475004;2.河南大學生命科學學院,河南開封475004)

升降二丹抗腫瘤作用的研究

李 紅1,戚笑笑1,李依芃2,杜鋼軍1*

(1.河南大學藥學院藥物研究所,河南開封475004;2.河南大學生命科學學院,河南開封475004)

目的 研究升降二丹對小鼠體表腫瘤的治療作用。方法 建立小鼠肝癌H22、肺癌lewis皮下移植腫瘤模型和小鼠乳腺癌模型,通過小鼠存活期、腫瘤體積、腫瘤抑制率、臟器指數(shù)等考察升降二丹對小鼠體表腫瘤生長的影響;用MTT法觀察升降二丹對lewis腫瘤細胞增殖的影響;ELISA法檢測瘤組織TNF-α及CEA含量,初步探討升降二丹的抗腫瘤機制。結(jié)果 升降二丹能使小鼠體表腫瘤逐漸縮小,延長荷瘤小鼠生存時間,阻止小鼠腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移,增加腫瘤組織TNF-α,減少腫瘤組織CEA;體外實驗,升降二丹在高濃度可抑制腫瘤細胞的增長。結(jié)論升降二丹有明顯的抗體表腫瘤作用,其機制可能與增加腫瘤組織TNF-α含量和減少腫瘤組織CEA含量有關。

升降二丹(紅升丹;白降丹);TNF-α;CEA;MTT

中藥在改善腫瘤患者的體質(zhì)、降低化療藥物的毒性、增強化療藥物的療效方面獨具特色[1]。升降二丹是中醫(yī)外科常用來提膿、祛腐的主藥,首載于明代陳實功[2]的《外科正宗》。升降二丹因效果靈驗,稱為靈藥,是外科圣藥,具有搜膿、拔毒、祛腐、生肌的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學認為,紅升丹除了傳統(tǒng)的提膿、祛腐作用外,還具有消腫、散結(jié)功能。

在中醫(yī)學術(shù)史上,癌瘤曾經(jīng)作為癰疽的一種,一般都是借鑒癰疽的治療方法。當代中醫(yī)也有人認為,癌瘤即為癌毒,可參考瘍科古法診治[3]。張?zhí)m鳳等人運用“循經(jīng)移瘡泄毒”治療癌腫,特別是對晚期肝癌患者循足厥陰肝經(jīng)在“膝關”穴實施移瘡泄毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在皰液中檢出高于血清濃度的癌胚抗原(CEA)等物質(zhì)。浦魯言等人還對“循經(jīng)移瘡泄毒法”治療晚期癌腫機理進行了探討,認為采用循經(jīng)移瘡泄毒法治療晚期癌腫是一種極具臨床應用價值的輔助療法。

目前,國內(nèi)外升降二丹抗腫瘤活性的研究報道相對較少。傳統(tǒng)中藥用藥經(jīng)驗認為,白降丹多用于提毒排膿,紅升丹多用于化腐生肌。我們認為,升降二丹可取長補短,既能將瘤毒引至體表,又能將之消散于無形。本文用小鼠肝癌H22、肺癌Lewis皮下移植模型和小鼠乳腺癌模型觀察了升降二丹對小鼠體表腫瘤的治療作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

紅升丹、白降丹:湖北省漢川北橋銀珠廠產(chǎn)品。

動物實驗:外用,取原生藥材紅升丹、白降丹各1 g,凡士林20 g,混合均勻制成涂抹藥膏,備用;內(nèi)服,取原生藥材紅升丹、白降丹各1 g,體積分數(shù)0.5% CMC-Na溶液(本實驗室自己配制)40 m L,混成均勻溶液。

細胞實驗:取原生藥材紅升丹、白降丹各1 g,用PEG 400 10 m L溶解,無菌濾器過濾,濾液無菌密封備用。

TNF-α和CEA ELISA試劑盒(深圳晶美公司提供,進口分裝);DMEM培養(yǎng)液(本實驗室配制);胎牛血清、PBS(本實驗室配制);胰酶、Tris-氯化銨裂解液、MTT、體積分數(shù)為0.5%CMC-Na溶液(本實驗室配制);DMSO(本實驗室配制);生理鹽水(本實驗室配制)。

1.2 動物和細胞株

昆明種小鼠,雌性,體質(zhì)量20±2 g,河南省醫(yī)學實驗動物中心提供(合格證號:豫動合字101號); C57BL/6,雌性,體質(zhì)量20±2 g,北京維通利華實驗動物有限公司提供;H22肝癌,本實驗室昆明鼠腹水傳代保存;lewis肺癌和4T1乳腺癌細胞株,中國科學院上海細胞庫提供,本實驗室保存。

1.3 儀器

HDL潔凈臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);快速混勻器SK-1(常州國華電器有限公司); El X800酶標儀(美國BIO-IEK公司);TDL-508臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜廠);電子天平FA1004N(上海精密儀器有限公司)。

2 方法

2.1 升降二丹對昆明小鼠肝癌H22移植性腫瘤生長的影響

無菌條件下,取昆明小鼠體內(nèi)傳代的H22腫瘤細胞,加無菌生理鹽水1∶7稀釋。于小鼠右后肢背部接種0.2 m L/只。次日將荷瘤小鼠隨機分為模型組(體積分數(shù)0.5%CMC-Na溶液0.2 m L/10 g)和給藥組(升降二丹1 g/kg)。灌胃給藥,每日2次。待腫瘤長出,隔天稱量小鼠體質(zhì)量,每隔一天用游標卡尺測腫瘤長徑、短徑1次。約3周后處死小鼠,剝離腫瘤、肝臟、脾臟和胸腺,并稱重。計算腫瘤抑制率及肝臟、胸腺、脾臟指數(shù)。

腫瘤體積(cm3)=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2;抑瘤率(%)=(正常對照組瘤質(zhì)量均值-用藥組瘤質(zhì)量均值)/正常對照組瘤質(zhì)量均值×100%;臟器指數(shù)%=臟器質(zhì)量均值(mg)/處死當日體質(zhì)量均值(g)×100%。

抑瘤率＞30%,P＜0.05,為抗腫瘤有意義。

2.2 升降二丹對C57BL/6小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響

將在體小鼠Lewis肺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細胞懸液,原液按1∶7稀釋。0.2 m L/只接種于20只C57BL/6小鼠尾靜脈,建立小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型。將C57BL/6小鼠隨機分為模型對照組和升降二丹治療組。每組10只小鼠。模型組按小鼠體質(zhì)量給體積分數(shù)0.5%CMC-Na溶液0.2 m L/10 g,2次/d,升降二丹治療組按小鼠體質(zhì)量灌胃升降二丹1 g/kg,2次/d。治療28 d后次日處死小鼠,切離肺臟,稱重。將稱重后的肺組織以體積分數(shù)10%福爾馬林(PBS)固定24 h,再用生理鹽水沖洗,計數(shù)肉眼可見各組肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)(個/每片)。

2.3 升降二丹凡士林藥膏對昆明小鼠移植性腫瘤生長的影響[4]

在無菌條件下,取昆明小鼠體內(nèi)傳代的H22腫瘤細胞,加無菌生理鹽水按1∶7稀釋。于小鼠右后肢背部接種0.2 m L/只。次日將荷瘤小鼠隨機分為模型對照組(涂抹凡士林膏)和升降二丹組(涂抹紅升丹、白降丹凡士林藥膏)。涂抹給藥,4次/d。待腫瘤長出,每隔一天稱量小鼠體質(zhì)量,2次/周用游標卡尺測腫瘤長徑、短徑一次,觀察腫瘤生長的外觀變化以及小鼠生存期。

2.4 升降二丹對lewis肺癌細胞生長的影響[5]

將lewis小鼠肺癌傳代細胞用胰酶-EDTA (2∶1)消化液消化(CO2培養(yǎng)箱中溫育消化)3 min。將消化后的細胞混懸液離心5 min,1 000 r/min,取細胞用含體積分數(shù)為10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液洗2遍,再用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度,制成單細胞懸浮液,調(diào)整細胞濃度,點96孔板,100μL/孔,5 000個細胞/孔。過夜貼壁。配藥物濃度,每個濃度4個復孔,點板加藥,100μL/孔。48 h后去除96孔板內(nèi)藥液,加入MTT,4 h后加DMSO,置于酶標儀570 nm測OD值。

腫瘤抑制率=(1-給藥組OD值/對照組OD值)×100%。

2.5 升降二丹對昆明小鼠皮下移植性肝腫瘤組織TNF-α及CEA的影響

取生長良好的荷肝癌昆明小鼠,抽取其腹水,用生理鹽水稀釋8倍,用此腹水稀釋液給20只雌性昆明小鼠一次性右后肢背部皮下注射(0.2 m L/只),建立肝癌模型。待腫瘤長出直徑8～10 mm時,將荷瘤小鼠隨機分為模型組和升降二丹組,每組10只小鼠。模型組瘤部涂不含藥基質(zhì)凡士林2次/d,升降二丹組瘤部涂含紅升丹、白降丹的凡士林膏4次/d,間隔4 h。治療14 d后次日處死小鼠,剝離腫瘤,低溫勻漿裂解組織后,離心取上清,用ELISA法檢測TNF-α及CEA含量。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 升降二丹對昆明小鼠移植性腫瘤生長的影響

與模型組相比,給藥組小鼠的生存期有所延長,見圖1;對H22荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響,見圖2;對H22荷瘤小鼠皮下腫瘤大小的影響,見表1;升降二丹對H22荷瘤小鼠腫瘤的生長有抑制作用,見圖3;對H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)有一定的影響,其中對脾臟指數(shù)影響最明顯(P＜0.01),見表2。

圖1 升降二丹對H22荷瘤小鼠存活時間的影響

圖2 升降二丹對H22荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響

表1 升降二丹對H22荷瘤小鼠皮下腫瘤大小的影響

圖3 升降二丹H22荷瘤腫瘤生長的影響

表2 升降二丹對H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

3.2 升降二丹對C57BL/6小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響

與模型組相比,升降二丹組能使荷Lweis小鼠體表腫瘤逐漸縮小,延長荷瘤小鼠生存時間,阻止小鼠腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移,見圖4、圖5。

圖4 升降二丹對荷Lewis肺癌小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移的影響

圖5 升降二丹對荷Lewis肺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的影響

3.3 升降二丹對lewis肺癌細胞增值的影響

實驗結(jié)果顯示,升降二丹在一定范圍內(nèi)可以抑制腫瘤細胞的增長,見表3。

3.4 升降二丹對小鼠H22皮下移植性肝腫瘤組織TNF-α及CEA的影響

實驗結(jié)果顯示,升降二丹能增加腫瘤組織TNF-α含量,減少腫瘤組織CEA含量,見圖6。

表3 升降二丹對lewis肺癌細胞的抑制率

圖6 升降二丹對小鼠H22皮下移植性肝腫瘤TNF-a及CEA的影響

4 討論

中藥的抑瘤率大于30%,并經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異時,可繼續(xù)實驗,連續(xù)3次實驗,療效穩(wěn)定,則評價此藥有一定的療效[6]。本實驗中,升降二丹能明顯影響瘤質(zhì)量,使其指數(shù)下降(P＜0.01),抑瘤率為38.46%,顯示有明顯的抑瘤作用;升降二丹能使小鼠體表腫瘤逐漸縮小,延長荷瘤小鼠生存時間,阻止小鼠腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移,增加瘤組織TNF-α含量,減少瘤組織CEA含量,對小鼠體表腫瘤有明顯的治療作用;升降二丹能明顯減少小鼠肺部結(jié)節(jié)數(shù),顯示對小鼠移植性腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。體外實驗中,用不同濃度紅升丹、白降丹作用于lewis肺癌細胞,一定濃度范圍內(nèi)對lewis細胞的生長有明顯的抑制作用。

升降二丹屬于重金屬類,是外科圣藥,具有搜膿、拔毒、祛腐、生肌的功效。中醫(yī)認為,癌是癰疽的一種,治療方法可借鑒癰疽治法[7]。當代中醫(yī)也有認為,癌瘤即為癌毒,可參考瘍科古法診治。長期以來,人們一直認為機體的免疫系統(tǒng)在腫瘤演進的過程中能夠清除腫瘤、保護自身,隨著研究的逐步加深越來越多的證據(jù)表明,腫瘤浸潤的免疫細胞不但不能發(fā)揮抗腫瘤作用。反而會促進腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移[8]。因此,降低因腫瘤而變大的臟器指數(shù),反而更有利于增加小鼠的存活率。這可從升降二丹對小鼠免疫器官的影響中得到驗證。本試驗中臟器指數(shù)均有所下降,而以脾臟指數(shù)最為明顯(P＜0.01)。這可能與升降二丹能減小因腫瘤而腫大的脾臟、胸腺等有關。

現(xiàn)代醫(yī)學腫瘤的治療仍處于綜合治療的時代,在循證醫(yī)學指導下的個體化的綜合治療是當今的標準治療方案,多采用以手術(shù)為主的綜合治療,即手術(shù)、放療、化療、生物治療及分子靶向治療等。放療、化療的毒副作用影響患者存活率,對晚期患者出現(xiàn)的并發(fā)癥(如癌熱、癌痛、骨相關事件、惡液質(zhì)等)療效欠佳,治愈率不高?，F(xiàn)代醫(yī)學的總體治療有效率約為30%～50%,也就是說約有一半的患者還無法治愈,且近年來治療進展較緩慢[9],因此,探求新理論、新觀念、新技術(shù)就顯得格外迫切。

中醫(yī)藥治療惡性腫瘤有數(shù)千年歷史,有確切的療效,是我國腫瘤治療的特色之一?？梢蕴岣呋颊呱钯|(zhì)量,延長患者帶瘤生存期,對放療、化療具有曾敏減毒作用。升降二丹能使小鼠體表腫瘤逐步縮小,延長荷瘤小鼠生存時間,阻止小鼠腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移,明顯抑制體表自發(fā)性腫瘤的生長。機制可能與增加瘤組織TNF-α含量,減少瘤組織CEA含量有關,對其作用機制進行更加深入的研究,對探求新理論、新觀念、新技術(shù)治療腫瘤,改善治療腫瘤的傳統(tǒng)方法有重要意義。

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[2]劉晶,張毅.紅升丹的研究進展[J].中醫(yī)外治雜志,2009, 18(1):57-58.

[3]李燕,吳新明,鐘非,等.移毒法的初步研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2011,17(10):1 126-1 128.

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[5]杜鋼軍,林海紅,許啟泰.燈盞花素促進阿霉素誘導的K562細胞凋亡[J].中國藥理學通報,2007,23(8): 1 043-1 047.

[6]楊培國,趙晶,張輝.松茸多糖化學組分及藥理作用研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2008,24(4):374-375.

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[8]郭勇.中醫(yī)腫瘤治療方法學探討[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2009,33(5):703-708.

[9]羌曹霞.循經(jīng)移瘡泄毒法治療晚期肝癌21例臨床觀察[J].新中醫(yī),2011,43(4):62-63.

[責任編輯 時 紅]

Study of hydrargyrum oxydatum grudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum on anti-tumor

LI Hong1，QI Xiaoxiao1，LI Yipeng2，DU gangjun1*
（1.Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Life science college of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To study the anti tumor effects of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum.Methods The transplanted tumor models of mouse H22，4T1 and lewis were established and the antitumor activity of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum was observed by the survival tumor size，tumor inhibition rate，organ index.The effects of hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum lewis tumor cells were examined by MTT method in vitro.The mechanism by which hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum showed the anti-tumor effects was explored by examining TNF-αand CEA levels in tumor tissue using ELISA. Results Hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum reduced tumor size，prolonged mouse survival time，prevented tumor metastasis，increased TNF-αlevel in tumor，and decreased CEA level in tumor.In vitro，hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum at high concentration can inhibit tumor cell growth.Conclusion Hydrargyrum oxydatum crudum bottom with hydrargyrum chloratum compositum has anti-tumor effect on skin tumor，and its mechanism might be related to increasing TNF-αand reducing CEA in tumor cells.

red upborne elixir with calomel；TNF-α；CEA；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0077-05

2013-09-30

國家自然科學基金項目(81173094);河南省高校青年骨干教師項目(2010GGJS-025);河南省科技廳重點攻關項目(112101310308);河南大學省部共建項目(SBGJ090704)。

李紅(1988-),女,河南商丘人,碩士研究生,從事中藥抗腫瘤藥理學研究工作。

*通訊作者:杜鋼軍(1971-),男,博士,教授,從事中藥抗腫瘤藥理學的研究工作。