高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苷

何長英

湖南省郴州市第三人民醫(yī)院藥劑科 湖南郴州 423000

高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苷

何長英

湖南省郴州市第三人民醫(yī)院藥劑科 湖南郴州 423000

目的:龍膽中龍膽苦苷的分離制備和含量測定。方法:采用HPLC測定龍膽中龍膽苦苷的含量和HSCCC分離制備龍膽苦苷;HPLC條件:以甲醇、0.1%磷酸溶液(甲醇:0.1%磷酸溶液=24:76)為流動相;流速1mL/min;檢測波長270nm;進樣量10μL，柱溫25oC。結(jié)果:經(jīng)測定，龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。選出正丁醇－水(1:1)為最佳溶劑體系，固定相保留率36.0%，分配系數(shù)0.714，上相作固定相，下相作流動相，轉(zhuǎn)速為850r/min，主機正轉(zhuǎn)，流速2mL/min，分離制備出的龍膽苦苷經(jīng)HPLC檢測，純度可達98%以上。結(jié)論:HSCCC儀器性能可靠、分析成本低、易于操作，可分離制備出高純度的龍膽苦苷。

高速逆流色譜;高效液相;龍膽苦苷;分離制備

龍膽為常用中藥，中醫(yī)取其苦寒之性，瀉肝膽實火，除下焦?jié)駸帷Ｔ谂R床上，龍膽是龍膽瀉肝湯、瀉青丸、當(dāng)歸龍薈丸等方劑的主藥，具瀉肝膽實火、清下焦?jié)駸嶂?。近年來用于健胃、抗腫瘤、治療急慢性肝炎、乙型腦炎、甲狀腺機能亢進等疾病亦取得良好療效。

目前國內(nèi)外對龍膽屬植物的化學(xué)成分做了大量的分離鑒定、藥理和臨床研究，龍膽含有龍膽苦苷(gentiopic2rin)、當(dāng)藥苷(sweroside)、當(dāng)藥苦苷(swertiam a rin)等裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類、生物堿、黃酮、甾體、香豆素、內(nèi)酯、糖及其苷類，酚性成分、微量元素、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、油脂類等化合物成分［1］。龍膽苦苷為其主要有效成分，且含量最高，被《中國藥典》定為龍膽的質(zhì)量控制目標(biāo)成分，具有抗菌、抗炎、健胃和保肝利膽等作用［2－6］〕。其結(jié)構(gòu)式如下

本文主要采用HPLC對HSCCC溶劑體系的分配系數(shù)的測定值和固定相保留率的測定值為依據(jù)，進行溶劑系統(tǒng)的篩選。再對HSCCC的轉(zhuǎn)速和體積流量進行單因素考察，找出HSCCC最佳的轉(zhuǎn)速和體積流量，以分離制備出高純度龍膽苦苷。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

KQ－250DE型超聲波清洗器

JMF－320多級閃蒸器

RE－3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵

DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋

GZX－DH－50X55－S型電熱恒溫干燥箱

高效液相色譜系統(tǒng)

TBE－300B高速逆流色譜儀

FA1104N電子天平

1.2 試藥

龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)批號為0912056，購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;甲醇為色譜純(美國fisher公司)乙醇、正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、冰醋酸、乙酸銨均為分析純，HPLC用水為娃哈哈純凈水。龍膽草產(chǎn)地為吉林。

2.實驗方法

2.1 超聲波提取

對原料龍膽草進行切段，段長1～2 cm，用天平稱取切段后的龍膽草1 kg，用5倍體積乙醇常溫浸泡12 h后，在25℃，250 W的條件下超聲提取30 min，將提取溶液采用布氏漏斗進行過濾。以上操作重復(fù)3次，合并其濾液濃縮至浸膏［7］，真空干燥成粉末，制備后的龍膽苦苷樣品儲存于冰箱中備用。

2.2 HPLC測定龍膽苦苷的含量

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24:76);檢測波長:270 nm;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl;柱溫:30℃。此色譜條件下，分離度＞1.5，理論塔板數(shù)在4000以上。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10 mg龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇超聲溶解，用甲醇定容，配制成1mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取龍膽提取物粉末50 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容配制成1 mg/mL的供試品溶液，超聲提取15 min，冷卻至室溫，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.3 HSCCC色譜條件

正丁醇－水(1:1)為溶劑體系，轉(zhuǎn)速為850 r/min，然后以2 ml/min的流速泵入流動相，待流動相流出兩相溶劑在柱中達到平衡狀態(tài)時，通過進樣閥注入樣品，進樣量0.200mg/20mL，280nm處紫外檢測器進行檢測，記錄色譜圖，收集流分。

3 結(jié)果與討論:

3.1 超聲波提取

計算得到龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。

3.2 HPLC測定龍膽苦苷含量

3.2.1 檢測波長的確定

取龍膽苦苷對照品溶液1.5 ml，以甲醇為空白，在紫外分光光度計下進行掃描，波長范圍200～600 nm。結(jié)果表明，龍膽苦苷在270 nm波長處有最大吸收，故選擇270 nm作為檢測波長。

3.2.2 HPLC色譜條件的摸索

本實驗曾選取不同比例的甲醇－水、甲醇－0.1%冰醋酸溶液、甲醇－0.2%乙酸銨溶液、甲醇－1%乙酸銨溶液、甲醇－0.1%磷酸等溶液作為流動相，以龍膽苦苷對照品及上述龍膽提取物在各條件下的分離度、理論塔板數(shù)為依據(jù)，最終確定最佳HPLC色譜條件為:色譜柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24: 76);檢測波長:270 nm;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl;柱溫:25℃。最佳條件下龍膽苦苷對照品及龍膽草樣品色譜圖。見圖1、圖2。

圖1 龍膽苦苷對照品(Figure 1 gentiopicroside reference substance)

圖2 龍膽苦苷樣品(Figure 2 Sample gentiopicroside)

3.2.3 加樣回收率實驗

精密稱取9份龍膽提取物粉末，每份2.5 mg，分別置于5mL容量瓶中，加少量的甲醇超聲溶解，再分別加入龍膽苦苷的對照品溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，以相同的色譜條件進樣，測得結(jié)果如表3所示。

表1 回收率實驗(n=9)(Table 3Test for recovery)

3.2.4 龍膽苦苷樣品含量測定

按供試品溶液制備方法，制備3批龍膽苦苷提取物，按最佳色譜條件進行含量測定，結(jié)果見表4。

表2

3.3 HSCCC分離龍膽苦苷

3.3.1 溶劑系統(tǒng)篩選

溶劑系統(tǒng)的選擇是高速逆流色譜應(yīng)用的關(guān)鍵，采用高效液相色譜對高速逆流色譜溶劑體系的分配系數(shù)的測定值和固定相保留率的測定值為依據(jù)，進行溶劑系統(tǒng)的篩選。實驗結(jié)果如表4、表5，

(1)以龍膽樣品中龍膽苦苷在溶劑體系中的分配系數(shù)為參考依據(jù)進行篩選，按下列公式計算:

分配系數(shù)=溶質(zhì)在固定相中的濃度CS/溶質(zhì)在流動相中的濃度CM結(jié)果如表5所示:

表3

根據(jù)分配系數(shù)在0.5－2的范圍內(nèi)分離效果較好的原則選擇進行高速逆流色譜分離。

(2)以溶劑體系的固定相保留率為參考依據(jù)進行溶劑的篩選，按下列公式計算:

固定相保留=(柱外流通管的死體積一管柱中推出的流動相體積)/管柱總體積

結(jié)果如表6所示:

表4

3.3.2 有效成分的分離

在最佳HSCCCC條件下。龍膽苦苷出峰時間為120.0－133.6min，固定相保留率36%，高速逆流色譜圖(圖4)

3.3.3 HPLC鑒定與檢測純度

將高速逆流色譜儀在120.0－133.6min收集到的組分HPLC檢測，記錄色譜圖，并與龍膽苦苷對照品在同條件下的色譜圖進行對比，確定HSCCC分離到得物質(zhì)為龍膽苦苷，見圖5和圖6。

4.小結(jié)

通過含量測定得到龍膽草中龍膽苦苷的含量為0.5411%。采用高速逆流色譜分離制備龍膽中龍膽苦昔，研究試驗得出:以正丁醇－水(1:1)為溶劑系統(tǒng)，上相作固定相，下相作流動相，轉(zhuǎn)速為850 r/min，固定相保留率36%，主機正轉(zhuǎn)，流速2 mL/min，龍膽苦昔出峰時間為120.0－133.6 min，經(jīng)HPLC檢測，純度可達98%以上，是目前分離龍膽苦苷的首選方法，簡便、快速、純度高。

圖3

圖4 龍膽苦苷的對照品(Figure 7 the reference substance gentiopicroside)

圖5 龍膽苦苷樣品(Figure 8 Sample gentiopicroside)

［1］宋·唐慎微.重修政和經(jīng)史證類備用小草［M］.卷六.北京:人民衛(wèi)生出版社，1957:163.

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