麻櫟樹皮多酚含量的測定及抗氧化活性的研究

楊春濤，曾曉麗，戴建輝，孫靜賢，李世源，李新明，黃相中，田 凱

（1.云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南昆明650500）

麻櫟樹皮多酚含量的測定及抗氧化活性的研究

楊春濤1，2，曾曉麗1，2，戴建輝1，2，孫靜賢1，2，李世源1，2，李新明1，2，黃相中1，2，田 凱1，2

（1.云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南昆明650500）

采用分光光度法、DPPH法和連苯三酚紅（PR）法對麻櫟樹皮提取物進行多酚化合物含量及抗氧化活性測定，討論了用不同溶劑提取對多酚含量的影響.結(jié)果表明采用70%乙醇進行提取，提取物中多酚含量最高，為（6 589.91±43.32）mg／100 g.抗氧化活性測試中，麻櫟樹皮的不同溶劑提取物對DPPH自由基和羥自由基都表現(xiàn)出較高的清除率，其中麻櫟樹皮70%丙酮提取物的活性最好，在0.18mg／mL質(zhì)量濃度下，對DPPH自由基清除率為70%，在0.38mg／mL質(zhì)量濃度下，對羥自由基氧化率為75%.

麻櫟；多酚類；抗氧化活性

麻櫟（Quercus acutissima Carruth）又名橡樹、櫟木，系殼斗科櫟屬（Quercus）落葉喬木，在我國分布廣泛，栽培歷史悠久，是傳統(tǒng)的優(yōu)良能源樹種［1-3］.麻櫟在我國常被作為中藥材使用，其果實、樹葉、樹皮具有解熱、收斂、止血等功效［4-5］.多酚類化合物是植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于植物體的皮、根、葉、殼和果肉中［6-7］.多酚類化合物具有多種生物活性，如降低血液尿素，抗過敏，抑制angiotension converting酶，抗胃蛋白酶，抗病毒等作用［8-11］.羅俠等［12］曾對麻櫟樹葉中黃酮類化合物進行研究，并對其抗氧化活性進行了評估，但尚未見文獻對麻櫟樹皮化學成分和藥理活性的研究，本文采用回流提取法研究麻櫟樹皮多酚類化合物的含量，研究了4種不同溶劑對提取物多酚含量的影響，并采用DPPH法和連苯三酚紅（PR）法對麻櫟樹皮提取物的抗氧化活性進行了評估.

1 主要材料與儀器

麻櫟樣品于2010年9月采自云南騰沖，經(jīng)云南民族大學楊青松副教授鑒定為Quercus acutissima Carruth，標本存于云南民族大學化學與生物技術(shù)學院標本室.麻櫟樹皮樣品粉碎備用；沒食子酸（北京市通廣精細化工公司生產(chǎn)）；二苯代苦味基自由基（DPPH）（日本東京化成株式會社生產(chǎn)）；連苯三酚（北京利德曼公司生產(chǎn)）；丙酮、三氯化鐵、鐵氰化鉀，鹽酸，無水乙醇，三氯化鐵，鐵氰化鉀均為分析純.WFJ-7200型分光光度計，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等.

2 實驗方法

2.1 麻櫟樹皮中多酚類化合物的提取

取麻櫟樹皮粉碎物40 g 4份，分別用體積分數(shù)為95%乙醇、70%乙醇、丙酮、70%丙酮回流提取2.5 h，趁熱過濾.重復(fù)提取3次，合并濾液；減壓蒸餾回收溶劑得提取物，放于室內(nèi)使其自然揮干，提取物質(zhì)量分別為：5.69、8.35、6.39、6.78 g.取各提取物以無水乙醇溶解配置成1.05、1.25mg／mL的溶液備用.

2.2 多酚含量的測定

2.2.1 標準曲線的建立

精密稱取沒食子酸對照品25mg于50mL容量瓶中，60%的乙醇溶解并加之刻度，得到0.5mg／mL的標準品溶液.精密吸取該溶液2.5mL于25mL的容量瓶中，加入60%的乙醇至刻度，配成50μg／mL的標準品溶液.參照文獻［13］，精密吸取沒食子酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25 mL比色管中，依次加入0.5mL的0.100mol／L三氯化鐵，0.50 mL的0.008 mol／L鐵氰化鉀0.50 mL和0.10 mol／L鹽酸，用60%乙醇定容，得到不同濃度的對照品溶液.置于暗處15min后，以蒸餾水為參比液，用WFJ-7200型分光光度計695 nm處測定吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標繪制標準曲線.

2.2.2 樣品的測定

取適宜體積已配置的麻櫟樹皮提取液，按標準曲線制備操作步驟于695 nm波長下分別進行吸光度的測定，根據(jù)標準曲線計算出每種提取方法的多酚類化合物含量及提取率.

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 DPPH法［14］分析樣品對自由基的清除能力

往10mL比色管中依次加入4mL pH為6.88標準磷酸鹽緩沖溶液，4mL 0.177 7mmol／LDPPH溶液，混勻，再加入一定量抗氧化劑溶液，用蒸餾水補至刻線，充分混勻，10min后在520 nm處測量吸光度.定義抗氧化劑對DPPH自由基的清除率K：

式中：A1為加抗氧化劑反應(yīng)后DPPH溶液吸光度；A2為不加DPPH，只加抗氧化劑及水的溶液的吸光度；Ac為未加抗氧化劑，只加DPPH及水的溶液的吸光度.按實驗方法加入不同體積的抗氧化劑（質(zhì)量濃度均為1.25mg／mL），測出A1，A2，Ac，據(jù)此計算出其相應(yīng)的自由基清除率K.

2.3.2 連苯三酚紅褪色光度［14］

往10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH為9.1的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，0.7mL 0.003 8mol／L EDTA-Fe2＋溶液，3.5mL 0.000 1mol／L連苯三酚紅溶液，0.7mL體積分數(shù)為0.6%H2O2溶液，蒸餾水補充至刻線后在25℃保溫反應(yīng)30min（均需搖勻），測544 nm處的吸光度.設(shè)不加H2O2時的吸光度為A0，加入H2O2后的吸光度為Ab，則羥自由基產(chǎn)生量可用ΔA＝A0-Ab來表示.在體系中加H2O2之前加入一定量的抗氧化劑，測定其吸光度A s，則抗羥自由基氧化率為S：

按實驗方法加入不同體積的抗氧化劑（質(zhì)量濃度均為1.05mg／mL），測出As，Ab，A0，計算出（As-Ab）／（A0-Ab）值，據(jù)此再計算出其相應(yīng)的抗羥自由基氧化率S.

3 結(jié)果與分析

3.1 多酚化合物含量測定結(jié)果

3.1.1 用沒食子酸為參比標準衡量樣品提取液中的多酚類化合物含量

以沒食子酸質(zhì)量濃度ρ（μg／mL）為橫坐標，695 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線，所得的回歸方程為y＝0.408 2 x-0.009，R2＝0.999 3，繪制的標準曲線見圖1.

3.1.2 測定方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性以及加標回收率

實驗結(jié)果如表1所示，從表中可見該方法實驗結(jié)果可靠，符合實驗要求.

3.1.3 樣品測定

分別吸取1.0mg／mL已配置的樣品溶液0.5mL于25mL量瓶中，依次加入0.100 mol／L三氯化鐵溶液0.5 mL、0.008 mol／L鐵氰化鉀溶液0.5 mL和0.10 mol／L鹽酸溶液0.5 mL，定容.按3.1.1項下的方法制備空白溶液.隨后空白溶液在695 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算樣品中多酚類化合物的含量，測定結(jié)果見表2.由表可知：麻櫟樹皮提取物中多酚類化合物含量均比較高，其中70%乙醇提取物的多酚含量最高，為（658 9.91± 43.32）mg／100 g.

表1 測定方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性及加標回收率的相對標準偏差（n＝5） %

表2 多酚含量測定結(jié)果 mg／100 g

3.2 抗氧化活性的測定

3.2.1 DPPH法分析樣品對自由基的清除能力

按實驗方法加入不同體積的抗氧化劑（質(zhì)量濃度均為1.25mg／mL）測出A1，A2，Ac，據(jù)此計算出其相應(yīng)的自由基清除率K，結(jié)果見圖2.從圖中可以看出：麻櫟樹皮提取物對DPPH自由基的清除率與其濃度呈正相關(guān)系，當達到一定濃度時，DPPH自由基清除率達到飽和，不再隨濃度的增加而增加；濃度為0.18mg／mL時，70%丙酮提取物對DPPH自由基的清除率達最大值，為70%.

3.2.2 連苯三酚紅褪色光度法

按實驗方法加入不同體積的抗氧化劑（質(zhì)量濃度均為1.05mg／mL）測出As，Ab，A0，據(jù)此計算出其相應(yīng)的抗羥自由基氧化率S，結(jié)果見圖3.由圖可知：麻櫟樹皮提取物的抗羥自由基氧化率隨提取物質(zhì)量濃度的增大而增大，當達到一定濃度時，其抗羥自由基氧化率達到飽和，不再隨質(zhì)量濃度的增大而增大；質(zhì)量濃度為0.38mg／mL時，70%丙酮提取物的抗羥自由基氧化率達最大值，為75%.

4 結(jié)語

用4種溶劑對麻櫟樹皮進行回流提取，發(fā)現(xiàn)4種提取物的多酚含量都比較高，表明麻櫟樹皮中多酚類化合物的含量較大.其中70%乙醇提取物的多酚含量最高，達到（6 589.91±43.32）mg／100g.表明70%乙醇溶液為提取麻櫟樹皮多酚的理想溶劑.采用2種方法對麻櫟樹皮提取物的抗氧化活性進行評估，得出麻櫟樹皮提取物對DPPH自由基和羥自由基均有較高的清除率，其中麻櫟樹皮70%丙酮提取物的活性最好，其在0.18mg／mL質(zhì)量濃度下，對DPPH自由基清除率達最大值，為70%.在0.38mg／mL質(zhì)量濃度下，對羥自由基氧化率達最大值，為75%.為進一步對麻櫟的開發(fā)和利用提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù).

［1］LIU Z L.，YU M K，TANG L Z，et al.Progress and utilization countermeasure of Quercus acutis-sima［J］.Forest By-Prod Special in China，2009，6：93-96.

［2］LIJ.Seedling and planting techniques of Quercus［J］.Modern Agricultural Science and Technology，2008，16：91-91.

［3］董玉鋒，姜岳忠，王華田.麻櫟無性系苗期性狀研究［J］.西北林學院學報，2007，2（6）：60-63.

［4］AKIYOSHI H，TOSHIHINO K，HAJIME O.Inhibitory effects of leaf extracts from Fagaceae on mutation in a streptomycin-de-pendent mutant of Salmonella typhimurium TA 98 under assay conditions without S-9mix［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1989，53：2807-2809.

［5］袁久志，孫啟時.麻櫟葉的化學成分研究［J］.沈陽藥科大學學報，1999，16（1）：60-62.

［6］趙揚帆，鄭寶東.植物多酚類物質(zhì)及其功能學研究進展［J］.福建輕紡，2006，11：107-110.

［7］劉運榮，胡健華.植物多酚的研究進展［J］.武漢工業(yè)學院學報，2005，12：63-65.

［8］唐傳核，彭志英.葡萄多酚類化合物以及生理功能［J］.中外葡萄與葡萄酒，2000，2：12-15.

［9］張峻，吉偉之，齊欣.葡萄籽中多酚類物質(zhì)的提取及其對油脂的抗氧化作用［J］.食品科學，2001，22（10）：43-45.

［10］BAGCHI D，BAGCHI M，STOHSS J，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract：importance in human health and disease prevention［J］.Toxicology，2000，148：187-197.

［11］BRUYNE TD，PIETERS L，DEELSTRA H，et al.Condenced vegetable tannins：biodiversity in structure and biological activities［J］.Biochemical Systematics and Ecoyogy，1999，27：445-459.

［12］羅俠，劉克忠，孫艷輝.麻櫟葉黃酮的提取及其抗氧化活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24：951-954.

［13］劉碩謙，劉仲華，黃建安.紫外分光光度法檢測水皂角總多酚的含量［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（6）：76-77.

［14］郭亞力，李聰.三種分光光度法對天然抗氧化物質(zhì)抗自由基性能的分析檢測［J］.分析試驗室，2004，23（10）：43-47.

（責任編輯 王 琳）

Polyphenol content and antioxidant activity of the barkof Quercus acutissima Carruth

YANG Chun-tao1，2，ZENG Xiao-li1，2，DAI Jian-hui1，2，SUN Jing-xian1，2，LI Shi-yuan1，2，LI Xin-ming1，2，HUANG Xiang-zhong1，2，TIAN Kai1，2
（1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China）

Polyphenol content of the extracts from the bark of Quercus acutissima Carruth was determined by spectrophotometric method.The antioxidant activity of the extracts was evaluated by the DPPH free radical scavenging assay and pyrogallol autoxidation assay，respectively.Furthermore，the polyphenol contents of different extracts from this plant were investigated.The results show that the polyphenol content of 70%ethanol extract was the highest，which was（6 589.91±43.32）mg／100 g.All of the different extracts from Q.acutissima have good activities against DPPH free radical and hydroxyl free radical，the results show that the 70%acetone extracts have exhibited better antioxidant activity against DPPH free radical at the concentration of 0.18mg／mL with the inhibition rate of70%，and 75%against hydroxyl free radical at0.38mg／mL.

Quercus acutissima Carruth；polyphenol；antioxidant activity

R931.6

A

1672-8513（2014）06-0404-04

2014-04-16.

國家自然科學基金（21262047）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（S2012FZ0227）；云南民族大學傳統(tǒng)傣藥研究創(chuàng)新團隊項目；SRT創(chuàng)新性實驗項目（2013HXSSRTY06）.

楊春濤（1988-），男，碩士研究生.主要研究方向：天然藥物化學.

田 凱（1971-），男，教授，碩士生導師.主要研究方向：天然產(chǎn)物化學與計算化學.