補(bǔ)陽還五湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3基因表達(dá)的影響

任巖 曹余恒 李杰萍

腦梗死是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病，約占急性腦血管病的70%~80%，有較高的病死率和致殘率，凋亡是腦缺血的神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。近來研究表明，Caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起重要的樞紐作用。補(bǔ)陽還五湯為《醫(yī)林改錯》中的成方，由黃芪、歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花七味藥組成，具有補(bǔ)氣活血、疏通經(jīng)絡(luò)的功效，是近代醫(yī)家用于治療中風(fēng)的常用方劑之一。本實驗應(yīng)用大鼠腦缺血再灌注（MCAO/R）模型，經(jīng)腹腔注射補(bǔ)陽還五湯，研究補(bǔ)陽還五湯對神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3表達(dá)的影響，討論其在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 補(bǔ)陽還五湯成分為黃芪60 g，赤芍10 g，川芎10 g，全當(dāng)歸10 g，干地龍10 g，紅花10 g，桃仁10 g，藥材購自煙臺市市直機(jī)關(guān)醫(yī)院藥劑科并經(jīng)鑒定，按本室方法制備濃度為1.5 g/mL的水煎醇提液。具體步驟如下：（1）將生藥浸入10 倍體積的蒸餾水浸泡2 h；（2）煮沸后文火煎1 h，過濾；（3）再加10倍體積的蒸餾水，煮沸后文火煎1 h，過濾；（4）重復(fù)步驟（3）；（5）將以上3次過濾液合并，濃縮成濃度為100%藥液，過濾；（6）置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊加入3 倍量無水乙醇，繼續(xù)攪拌過夜；（7）過濾，2000 rpm/min離心30 min，取上清液；（8）上清液揮發(fā)盡乙醇，制成濃度為1.5 g/mL的溶液；（9）高壓滅菌后，4 ℃保存。

1.2 制作動物模型 隨機(jī)選擇SPF級成年雌性Wistar大鼠40只（體重230~250 g），由煙臺市濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。首先將實驗動物放置于實驗室內(nèi)1周，保持自由進(jìn)食和飲水，維持室溫恒定。手術(shù)前12小時開始禁食。隨機(jī)選擇30只動物，按照線栓法（經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線）建立腦缺血2 h后再灌注22 h的動物模型，術(shù)后2 h對模型是否成功進(jìn)行評估，評估標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)左側(cè)Horner征、提尾時右前肢屈曲、爬行時向右側(cè)劃圈行為。將20只成功建立腦缺血再灌注模型的大鼠隨機(jī)平均分為陰性對照組和補(bǔ)陽還五湯治療組。剩余10只未做模型的大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組動物僅在左側(cè)頸內(nèi)動脈插線后隨即將線抽出。實驗過程中及術(shù)后狀態(tài)不佳的動物棄去不用，另取動物補(bǔ)充。

1.3 用藥干預(yù)處理 治療組動物在栓塞2 h后再灌注前以腹腔注射給予補(bǔ)陽還五湯（每公斤體重給予16 g），假手術(shù)組和陰性對照組動物腹腔注射等量的0.1 mol/L PBS緩沖液。

1.4 神經(jīng)功能評分 再灌注22 h后對三組動物的神經(jīng)功能進(jìn)行評分。3分：栓塞對側(cè)前肢屈曲，栓塞對側(cè)肩部抵抗減弱，且自由活動時有劃圈表現(xiàn)；1分：栓塞對側(cè)前肢屈曲，肩部抵抗減弱，但無劃圈；0分：無神經(jīng)功能異常癥狀。

1.5 制備石蠟切片 每組隨機(jī)選取5只大鼠，水合氯醛麻醉，仰臥位固定后，0.9%氯化鈉心臟灌注，然后用4%甲醛心臟灌注，將鼠腦取出，置于4%甲醛溶液中再固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。冠狀位切片。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 將石蠟切片脫蠟水化，用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Santa Cruz公司）進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下用藍(lán)色激發(fā)光照射，在高倍鏡下在皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)隨機(jī)各取5個視野計數(shù)發(fā)出黃綠色熒光的陽性細(xì)胞。

1.7 免疫組化檢測 將石蠟切片脫蠟水化，用即用型SABC免疫組化試劑盒試劑盒進(jìn)行操作（兔抗鼠Caspase-3抗體由Santa Cruz公司提供），DAB顯色（DAB染液由武漢博士德生物公司提供），用LEICA Qwin圖像處理系統(tǒng)分析皮質(zhì)、紋狀體和海馬區(qū)各5個視野的吸光度值（A）。

1.8 酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測 每組隨機(jī)選取5只大鼠，腹腔麻醉后，仰臥位固定，生理鹽水心臟灌注，取出鼠腦，將其放置于液氮中快速冷凍。用超聲粉碎器將鼠腦制成腦組織勻漿，離心后取上清。用ELISA試劑盒（購于BG公司）檢測腦組織勻漿中的Caspas-3含量。使用酶標(biāo)儀（450 nm）測OD值，繪制以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品的OD值查其在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度（單位：μg/L）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5版本統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以（s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)功能無異常，評分為0分。陰性對照組評分（2.25±0.34）分，顯著高于假手術(shù)組0分（P<0.05）。補(bǔ)陽還五湯組評分（1.28±0.38）分，顯著低于陰性對照組（P<0.05）。

2.2 凋亡陽性細(xì)胞數(shù) 假手術(shù)組腦組織切片僅觀察到散在分布的少量凋亡細(xì)胞，陰性對照組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多，陽性細(xì)胞主要分布于皮質(zhì)、紋狀體、海馬。補(bǔ)陽還五湯組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表 1。

表1 三組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（s）

表1 三組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較（s）

*與假手術(shù)組同區(qū)域比較，P<0.05；Δ與陰性對照組同區(qū)域比較，P<0.05

組別 皮質(zhì)區(qū) 紋狀體區(qū) 海馬區(qū)假手術(shù)組（n=5）3.57±1.25 3.11±1.65 2.32±1.88陰性對照組（n=5）19.54±3.39* 16.35±2.77* 13.69±2.38*補(bǔ)陽還五湯組（n=5）8.94±2.25Δ 7.73±2.16Δ 6.20±1.67Δ

2.3 Caspase-3表達(dá) 皮質(zhì)、紋狀體和海馬三區(qū)的Caspase-3吸光度值（A）無顯著差異，故將三區(qū)數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計。假手術(shù)組Caspase-3表達(dá)微弱，陰性對照組Caspase-3吸光度值（A）顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。補(bǔ)陽還五湯組Caspase-3表達(dá)顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表2。

2.4 Caspase-3濃度檢測 假手術(shù)組腦組織勻漿中Caspase-3含量很低，而陰性對照組明顯上升。補(bǔ)陽還五湯組Caspase-3含量顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表2。

表2 三組Caspase-3吸光度值和定量檢測比較（s）

表2 三組Caspase-3吸光度值和定量檢測比較（s）

*與假手術(shù)組比較，P<0.05；Δ與陰性對照組比較，P<0.05

組別 吸光度值（A）濃度（μg/L）假手術(shù)組（n=5）0.19±0.09 15.48±2.66陽性對照組（n=5）0.67±0.20* 48.33±5.78*補(bǔ)陽還五湯組（n=5）0.25±0.13Δ 23.96±4.01Δ

3 討論

補(bǔ)陽還五湯是一劑補(bǔ)氣活血通絡(luò)的方藥，主治中風(fēng)后遺癥，如半身不遂、口眼歪斜、語言艱澀、遺尿不禁等。此方由清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立，為后世醫(yī)家所推崇，沿用至今已一百多年。王氏認(rèn)為，中風(fēng)的病機(jī)為氣虛血滯導(dǎo)致腦絡(luò)淤阻，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，方劑中的君臣佐使各藥主要起補(bǔ)氣活血的作用。這是中醫(yī)中補(bǔ)陽還五湯的藥理機(jī)制。如今，隨著人們對腦中風(fēng)的病理機(jī)制的研究逐漸深化，腦缺血后細(xì)胞和分子水平的病理機(jī)制正在逐漸被揭示。

Nitatori T等人在上個世紀(jì)發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后，海馬CAl區(qū)出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡。目前已有大量研究都證實這種遲發(fā)性神經(jīng)元死亡與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，提示腦缺血的神經(jīng)細(xì)胞損傷不只是壞死，而且與凋亡密切相關(guān)。當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生之后，壞死和凋亡同時發(fā)生，壞死細(xì)胞主要集中在缺血中心區(qū)，而凋亡細(xì)胞主要集中在缺血周圍區(qū)。隨著再灌注時間加長，缺血周圍區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量會逐漸增加，到24 h達(dá)到高峰。這說明在腦缺血引發(fā)的細(xì)胞漸進(jìn)死亡過程中，細(xì)胞凋亡是一種重要形式。所以，抗凋亡是腦缺血的一種必要的治療手段。

Caspase-3蛋白是參與凋亡過程的一種重要的蛋白質(zhì)。腦缺血時，Caspase-3蛋白表達(dá)也明顯升高，而且Caspase-3的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化一致，兩者不僅在相同區(qū)域出現(xiàn)，并且?guī)缀跬瑫r達(dá)到高峰，因此Caspase-3與缺血性神經(jīng)元凋亡的關(guān)系非常密切。研究顯示，Caspase-3是介導(dǎo)凋亡的一種重要的蛋白酶，在腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[1-2]。

筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血及再灌注模型組神經(jīng)元凋亡細(xì)胞和Caspase-3的表達(dá)明顯增多，補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡受到了抑制，并減少了Caspase-3的表達(dá)，從而證明了補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的機(jī)制與抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，并且其抗凋亡的機(jī)制之一是通過調(diào)控Caspase-3基因表達(dá)實現(xiàn)的，但這種調(diào)控的分子機(jī)制以及是否同時合并其他的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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