二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)高效篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的思路與方法

韋英杰+景莉君+詹揚(yáng)+孫娥+賈曉斌

[摘要] 目的：提出以二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)突破評價(jià)模型和化合物數(shù)量制約，建立高效篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分新方法。方法：根據(jù)本課題組相關(guān)研究及國外有關(guān)文獻(xiàn)資料，依據(jù)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型可高效評價(jià)活性，斑馬魚代謝模型可高效富集代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)可高效分離、分析中藥成分，提出三者有機(jī)聯(lián)合有望高效解碼中藥抗骨質(zhì)疏松體內(nèi)、外藥效物質(zhì)。結(jié)果與結(jié)論：該方法使中藥成分特別是量微成分與代謝產(chǎn)物的富集、分離分析、在體抗骨質(zhì)疏松活性篩選簡單、高效，充分體現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)含原形成分及代謝產(chǎn)物，具“多成分，多靶點(diǎn)，整體作用”的特點(diǎn)，為中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的早期、快速發(fā)現(xiàn)提供新思路與方法。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚； 骨質(zhì)疏松； 藥物代謝； 色譜聯(lián)用； 活性篩選

骨質(zhì)疏松癥是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨礦成分和骨基質(zhì)等比例的不斷減少，骨質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)度升高的一種全身骨代謝障礙的疾病。抗骨質(zhì)疏松藥物越來越受到重視。但中藥成分特別是量微成分的抗骨質(zhì)疏松活性篩選尚難以簡單、高效的進(jìn)行，主要存在2個(gè)瓶頸問題：一是評價(jià)模型問題，現(xiàn)有哺乳動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型耗時(shí)長，樣品用量大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，效率低，不適于活性高效篩選；現(xiàn)有成骨、破骨細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞替代模型作用環(huán)節(jié)單一，難以體現(xiàn)整體觀；此外，成本高，實(shí)驗(yàn)條件相對苛刻，原代細(xì)胞培養(yǎng)難度增加，普通實(shí)驗(yàn)室難以進(jìn)行。二是化合物的數(shù)量問題，由于中藥成分復(fù)雜，藥效成分包括原形成分和代謝成分，很難分離到能滿足在體活性評價(jià)所需的足量化合物，且量微成分及體內(nèi)代謝成分的富集、分離難度更大。如何突破二者制約，實(shí)現(xiàn)中藥成分特別是量微成分及其代謝物的抗骨質(zhì)疏松活性高效篩選具有重要意義。

1斑馬魚骨質(zhì)疏松模型有望突破量微成分難以進(jìn)行在體評價(jià)的技術(shù)瓶頸

斑馬魚是近年來被廣泛用于高通量藥效篩選的重要工具。用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，具有化合物用量少（μg～mg），簡單、高效、高靈敏及低成本的優(yōu)勢，可有效用于中藥成分特別是量微成分及其復(fù)雜體系的抗骨質(zhì)疏松活性評價(jià)。

1.1斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的依據(jù)與國內(nèi)、外研究現(xiàn)狀 斑馬魚與哺乳動(dòng)物骨骼生長發(fā)育的分子機(jī)制極為相似，斑馬魚的骨骼是從3種胚胎干細(xì)胞系發(fā)育而來，幼魚骨包含骨形成和骨吸收活動(dòng)所需的細(xì)胞。骨骼形成機(jī)制也包括軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化，參與調(diào)控的關(guān)鍵基因，如Runx2， osteonectin， osteoprogerin等與哺乳動(dòng)物的相關(guān)基因具有高度的同源性^[1]。

2005年，F(xiàn)leming等通過對加藥后斑馬魚頭部骨骼的發(fā)育觀察，證明斑馬魚模型可以用于篩選促進(jìn)骨骼發(fā)育的藥物（維生素D3、依替膦酸等）^[2]，之后Fleming等用糖皮質(zhì)激素氫化潑尼松（prednisolone）誘導(dǎo)并建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，并證實(shí)目前抗骨質(zhì)疏松常用藥物依替膦酸（etidronate）和阿侖唑奈（alendronate）在斑馬魚模型中同樣具有明顯藥效^[3-4]。至此，斑馬魚作為高效、快速、高通量篩選促進(jìn)骨骼生長、治療骨科疾病藥物的在體模型受到研究人員關(guān)注^[5-7]。目前，斑馬魚骨質(zhì)疏松模型已被做為比較成熟的、認(rèn)可的一種在體動(dòng)物模型用于藥物（如licochalcone A） 抗骨質(zhì)疏松作用評價(jià)^[8]。

在國內(nèi)，斑馬魚做為新型骨骼研究模式生物模型已受到關(guān)注^[9]，本課題組依據(jù)國內(nèi)、外的相關(guān)研究基礎(chǔ)，提出建立模式生物斑馬魚中藥壯骨效應(yīng)評價(jià)新模型。已成功建立糖皮質(zhì)激素地塞米松和潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，并用于評價(jià)依替膦酸二鈉及淫羊藿、續(xù)斷代表成分的抗骨質(zhì)疏松活性（圖1）^[10-12]。

1.2斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的特色與優(yōu)勢 ①用樣量少、靈敏度高：藥物質(zhì)量濃度μg·L^{-1～mg·L-1，μg～mg樣品足夠?qū)嶒?yàn)；② 高通量：實(shí)驗(yàn)在微孔板進(jìn)行，適合批量篩選；③簡單、高效：實(shí)驗(yàn)條件簡單、易控、易普及；耗時(shí)短，約為7～9 d；④成體低：約是大鼠的1/1 000；⑤環(huán)境條件要求低：不需要超凈室，一般具有空調(diào)的普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行。}

2斑馬魚代謝模型可有效用于量微成分的在體代謝，益于代謝產(chǎn)物的高效富集

中藥體內(nèi)成分含量低，常采用體外代謝模型富集代謝產(chǎn)物，如肝細(xì)胞、微粒體、代謝酶及腸菌轉(zhuǎn)化等。但肝細(xì)胞、微粒體和代謝酶制備相對復(fù)雜，保持生物活力條件要求高，腸菌轉(zhuǎn)化基質(zhì)復(fù)雜，不利于代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步純化，且體外模型作用環(huán)節(jié)相對單一。斑馬魚代謝模型簡單、高效，能模擬哺乳動(dòng)物進(jìn)行I相，Ⅱ相及腸菌代謝及其綜合作用，為代謝產(chǎn)物的富集提供新方法、新選擇。

2.1斑馬魚代謝模型的依據(jù)與國內(nèi)、外研究現(xiàn)狀 斑馬魚具有完整的器官系統(tǒng)和與哺乳動(dòng)物相似的基因，具有藥物代謝的相關(guān)酶系如I相代謝細(xì)胞色素P450酶和Ⅱ相代謝的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及硫酸轉(zhuǎn)移酶等，此外尚含腸菌代謝的腸道菌群，為其用于藥物代謝研究提供了有力依據(jù)^[13]。

本課題組提出“基于模式生物斑馬魚模型的中藥代謝研究新方法的建立”，獲得國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目支持。建立了斑馬魚藥物代謝的簡單、可行方法：將斑馬魚置于含有20～30 mL溶液的玻璃瓶中，則魚會(huì)通過皮膚和腔道自主連續(xù)的從溶液中吸收藥物，藥物的代謝物也會(huì)隨著斑馬魚的排泄物被連續(xù)的排到水中，定時(shí)取藥液或魚體，采用LC-MS分析代謝產(chǎn)物，可全面掌握代謝信息。

將該方法用于丹參中二萜醌類單體、單體組合物及總丹參酮的代謝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參二萜醌類化合物的脫氫與羥基化的I相代謝反應(yīng)，這與現(xiàn)有代謝結(jié)論（大鼠體內(nèi)、肝微粒體、細(xì)胞色素P450）的代謝機(jī)制一致；進(jìn)一步研究表明，斑馬魚也可用于Ⅱ相代謝及腸菌代謝研究，且能體現(xiàn)多種代謝途徑的綜合結(jié)果：斑馬魚能使5-羥基黃酮、7-羥基黃酮及白楊素（5，7-二羥基黃酮）發(fā)生硫酸化和葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代謝反應(yīng)；使淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定C發(fā)生脫葡萄糖殘基的腸菌代謝反應(yīng)；使三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷VI發(fā)生羥基化I相代謝及脫糖基的腸菌代謝反應(yīng)，且上述代謝產(chǎn)物與現(xiàn)有人或大鼠或體外代謝產(chǎn)物具一致性。上述研究提示斑馬魚與現(xiàn)有代謝模型具有良好的相關(guān)性^[14-17]。目前，斑馬魚已成為一種被認(rèn)可的、較成熟的在體代謝模型用于量微成分代謝研究^[18]。

2.2斑馬魚代謝模型的優(yōu)勢 斑馬魚最大限度地保留哺乳動(dòng)物代謝的系統(tǒng)性，能體現(xiàn)在體I相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結(jié)果，適于單體化合物及其組合物等代謝研究。該模型突破了量微成分難以進(jìn)行在體代謝的瓶頸，具簡單、高效、低成本、化合物用量少（μg～mg）的優(yōu)勢，益于代謝產(chǎn)物的簡單、高效富集。

3二維斑馬魚模型聯(lián)合色譜技術(shù)篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的思路與方法

3.1二維斑馬魚模型與現(xiàn)代色譜聯(lián)用的聯(lián)合思路與方法提出 二維斑馬魚模型在這里指斑馬魚骨質(zhì)疏松模型和斑馬魚代謝模型：斑馬魚骨質(zhì)疏松模型可用于量微成分（藥物質(zhì)量濃度μg·L^{-1～mg·L-1）抗骨質(zhì)疏松活性的在體高效篩選。斑馬魚代謝模型可模擬體內(nèi)I相、Ⅱ相、腸菌代謝及多途徑代謝綜合結(jié)果，突破量微成分難以進(jìn)行在體代謝的瓶頸，用于代謝產(chǎn)物的高效富集以供生物活性評價(jià)。}

現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)：現(xiàn)代色譜特別是多種色譜組合、多維色譜及其聯(lián)用技術(shù)具強(qiáng)大的化合物富集、分離、分析功能，通過不同柱填料組合、檢測器組合及與多種質(zhì)譜或NMR聯(lián)用，可有效用于從無機(jī)到有機(jī)、從極性到非極性、從小分子到大分子復(fù)雜體系的全成分的分離分析。易于實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)雜成分及其代謝物的定向捕獲或敲除，收集到的成分（群）足夠斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的活性篩選。

綜上，可將二維斑馬魚模型與現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)有機(jī)聯(lián)合，有望使中藥成分特別是量微成分與代謝物的富集、分離、分析及在體抗骨質(zhì)疏松活性篩選一體化。

用該思路方法，采用斑馬魚代謝模型對1 mg淫羊藿苷進(jìn)行代謝，代謝液用LC-MS分析、HPLC捕獲代謝產(chǎn)物寶藿苷I（圖2），用斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價(jià)活性，結(jié)果表明淫羊藿苷和寶藿苷I均能防止?jié)娔崴升堈T導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松，且代謝物寶藿苷I的活性優(yōu)于淫羊藿苷（圖3，4）。提示該方法使量微成分及其代謝物的富集、分離分析、活性評價(jià)一體化，該思路方法具可行性。

3.2二維斑馬魚模型聯(lián)合現(xiàn)代色譜聯(lián)用篩選中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分的方法 擬選擇傳統(tǒng)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨中藥為代表（如淫羊藿、續(xù)斷等），采用斑馬魚代謝模型輔助代謝產(chǎn)物富集，以現(xiàn)代色譜及其聯(lián)用技術(shù)分離、捕獲、敲除或鑒定原形及代謝成分（群），采用斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，以骨礦化量為指標(biāo)評價(jià)活性，以實(shí)現(xiàn)兼顧原形及代謝產(chǎn)物的中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分（群）的系統(tǒng)、高效篩選（技術(shù)路線見圖5）。另選擇代表活性成分及其代謝物的大鼠或細(xì)胞模型結(jié)果與斑馬魚模型結(jié)果進(jìn)行對比、驗(yàn)證，以深入驗(yàn)證斑馬魚模型的合理性。

4討論與展望

藥物在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生效應(yīng)或毒性，有效物質(zhì)包括原形成分和代謝產(chǎn)物，故在藥效篩選過程中有必要兼顧體內(nèi)外成分。目前，抗骨質(zhì)疏松藥物篩選主要存在2個(gè)瓶頸：藥效評價(jià)模型和化合物數(shù)量（含代謝物），現(xiàn)有體、內(nèi)外模型難以進(jìn)行量微成分及其代謝物的在體抗骨質(zhì)疏松活性評價(jià)。

作者前期提出并建立了斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，實(shí)現(xiàn)量微成分抗骨質(zhì)疏松高效評價(jià)^[10-12]；建立的斑馬魚代謝模型可簡單、高效富集代謝產(chǎn)物^[15-17]，且現(xiàn)代色譜及聯(lián)用技術(shù)可高效分離、分析及定向捕獲成分（含代謝物）。故三者有機(jī)聯(lián)合可同時(shí)突破評價(jià)模型和化合物數(shù)量制約，實(shí)現(xiàn)兼顧原形成分及代謝產(chǎn)物的抗骨質(zhì)疏松藥物高效篩選。

以淫羊藿為代表，將該思路與方法用于高效篩選淫羊藿抗骨質(zhì)疏松體內(nèi)外活性成分（群）。該方法使中藥成分特別是量微成分與代謝產(chǎn)物的富集、分離分析、在體抗骨質(zhì)疏松活性篩選一體化，簡單、高效，充分體現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)含原形成分及代謝產(chǎn)物，具“多成分，多靶點(diǎn)，整體作用”特點(diǎn)，為基于整體觀的中藥抗骨質(zhì)疏松活性成分早期、快速發(fā)現(xiàn)提供新思路與新方法。

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Ideas and methods of two-dimensional zebrafish model combined with

chromatographic techniques in high-throughput screening of active

anti-osteoporosis components of traditional Chinese medicines

WEI Ying-jie1，2*， JING Li-jun1，2， ZHAN Yang1， SUN E1， JIA Xiao-bin1

（1.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica under State Administration of Traditional

Chinese Medicine， Jiangsu Academy of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Branch of China Academy of Chinese

Medical Science， Nanjing 210028， China； 2. Affiliated Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China）

[Abstract] Objective： To break through the restrictions of the evaluation model and the quantity of compounds by using the two-dimensional zebrafish model combined with chromatographic techniques， and establish a new method for the high-throughput screening of active anti-osteoporosis components. Method： According to the research group-related studies and relevant foreign literatures， on the basis of the fact that the zebrafish osteoporosis model could efficiently evaluate the activity， the zebrafish metabolism model could efficiently enrich metabolites and the chromatographic techniques could efficiently separate and analyze components of traditional Chinese medicines， we proposed that the inherent combination of the three methods is expected to efficiently decode in vivo and in vitro efficacious anti-osteoporosis materials of traditional Chinese medicines. Result and conclusion： The method makes it simple and efficient in the enrichment， separation and analysis on components of traditional Chinese medicines， particularly micro-components and metabolites and the screening anti-osteoporosis activity， fully reflects that efficacious materials of traditional Chinese medicines contain original components and metabolites， with characteristic of "multi-components， multi-targets and integral effect"， which provides new ideas and methods for the early and rapid discovery of active anti-osteoporosis components of traditional Chinese medicines.

[Key words] zebrafish； osteoporosis； drug metabolism； combined chromatography； activity screening

doi：10.4268/cjcmm20140938endprint