細(xì)胞色素P450蛋白酶催化下環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)機(jī)理的理論研究

張笑乾，李朝正，劉玉芳

（河南師范大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，新鄉(xiāng)453007）

1 引 言

細(xì)胞色素P450蛋白酶（簡稱P450）是一類血紅素蛋白的超家族，被譽(yù)為“世界上最萬能的生物催化劑”，因其在藥物等外源化合物的代謝以及性激素等內(nèi)源化合物的生物合成過程中的重要催化作用，而被越來越多的人所熟知．這一類單加氧酶可以參與催化眾多化學(xué)反應(yīng)，諸如非活潑碳?xì)浠衔锏牧u基化反應(yīng)、脫烷基反應(yīng)以及脫氨基反應(yīng)等等[1]．其中，脫氨基反應(yīng)中的機(jī)理細(xì)節(jié)，尤其是涉及碳?xì)滏I氧化過程的一些機(jī)理細(xì)節(jié)在過去幾十年中引起了相當(dāng)大的爭議，雖然大量基于此過程的實驗數(shù)據(jù)和研究結(jié)果已被報道，但仍未能完全解決這個頗具爭議性的問題[2－6]．因此，針對相關(guān)機(jī)理的理論計算，不僅可以揭示反應(yīng)機(jī)理細(xì)節(jié)，對相關(guān)實驗結(jié)果給出合理解釋，還可以使發(fā)現(xiàn)新的機(jī)理特征成為可能，從而進(jìn)一步指導(dǎo)實驗進(jìn)行更深入的研究．本文以細(xì)胞色素P450蛋白酶催化下環(huán)己胺的脫氨基反應(yīng)為例，對其反應(yīng)機(jī)理細(xì)節(jié)進(jìn)行了研究．

圖1所示為細(xì)胞色素P450催化環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)的整個反應(yīng)過程，其中關(guān)于Cα－H鍵的氧化過程涉及兩個假設(shè)機(jī)理．反應(yīng)的第一步是環(huán)己胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的碳自由基中間體（Ⅰ－Ⅱ或Ⅲ過程），隨后自由基中間體經(jīng)過一個氧反彈過程[7－8]（Ⅳ過程）生成1－羥基－環(huán)己胺，接下來1－羥基－環(huán)己胺進(jìn)一步分解（Ⅴ過程）成為環(huán)己酮和氨氣，整個分解過程可以通過一個水分子的輔助，在非酶環(huán)境中進(jìn)行．關(guān)于機(jī)理細(xì)節(jié)的爭議主要集中在環(huán)己胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘甲杂苫虚g體這一步．其中一個機(jī)理是單電子傳遞（SET）機(jī)理[6]（Ⅰ－Ⅱ過程），首先一個電子從環(huán)己胺的氮原子上傳遞到酶活性中心（Ⅰ過程），生成氨基陽離子自由基中間體，然后這個中間體再向酶活性中心傳遞一個質(zhì)子（Ⅱ過程），至此生成一個碳自由基中間體；與之不同的另外一個機(jī)理是氫原子傳遞（HAT）機(jī)理[2－5]（Ⅲ過程），即一個氫原子由環(huán)己胺傳遞到酶活性中心，直接生成碳自由基中間體．

在過去幾十年中，支持不同假設(shè)機(jī)理的研究結(jié)果紛紛被報道．一些實驗結(jié)果顯示P450催化的脫烷基反應(yīng)中涉及Cα－H鍵氧化過程的動力學(xué)同位素效應(yīng)相對較小[6，9－12]，是一個Cα的去質(zhì)子化過程，Kurebayashi[13]進(jìn)而指出環(huán)己胺的脫氨基反應(yīng)同樣顯示出較小的動力學(xué)同位素效應(yīng)；同時，在P450及其同功酶的催化下，針對對位取代的苯胺脫甲基反應(yīng)中線性自由能關(guān)系的研究結(jié)果得到一個較大的負(fù)Hammettρ值，并且反應(yīng)速率常數(shù)與底物的氧化還原勢有關(guān)[14－16]．這些研究結(jié)果都支持了反應(yīng)是涉及SET機(jī)理的．然而Jurva[17]等人針對P450催化下的環(huán)丙基胺氧化反應(yīng)的模型電化學(xué)－質(zhì)譜的研究結(jié)果顯示，反應(yīng)中的氨基陽離子自由基中間體并不是必須的；李春森[18]等人針對P450催化苯胺羥基化反應(yīng)和王永[19]等人針對P450催化N，N-二甲基苯胺脫甲基反應(yīng)的理論計算結(jié)果都無一例外地支持了HAT機(jī)理．

圖1 P450催化環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)的兩種假設(shè)機(jī)理Fig．1 Two hypothetical mechanisms of the deamination of cyclohexylamine catalyzed by P450

為了揭示由P450催化的環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)中涉及的反應(yīng)機(jī)理細(xì)節(jié)，我們進(jìn)行了一系列的密度泛函理論（DFT）計算的研究，并以DFT計算結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行了相關(guān)的動力學(xué)同位素效應(yīng)計算，結(jié)果顯示反應(yīng)中Cα－H鍵氧化的過程是一個氫原子傳遞過程，從理論計算的角度很好地支持了HAT機(jī)理，計算結(jié)果還顯示反應(yīng)最后一步分解過程是在一個水分子的輔助下在非酶環(huán)境中進(jìn)行的．

2 計算模型與方法

為了通過密度泛函理論計算揭示P450催化環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)的機(jī)理細(xì)節(jié)，我們使用了Fe4＋O2－（C20N4H12）－（SH）－化 合 物[19－22]作 為 P450氧 化單體Cpd I的模型，使用環(huán)己胺（C6H13N）作為底物．相關(guān)的DFT計算通過使用Gaussian 09[23]軟件包來實現(xiàn)，其中涉及混合泛函B3LYP[24]以及兩個基組：一個是 LACVP（Fe）／6-31G＊＊（H，C，N，O，S），簡稱為B1基組，用來對過渡態(tài)和其它穩(wěn)定點進(jìn)行非對稱性限制的優(yōu)化；另一個是LACV3P＋＊＊（Fe）／6-311＋G＊＊（H，C，N，O，S），簡稱為B2基組，用來進(jìn)行單點能（E1）和溶劑化校正（E2）的計算．上述計算模型與計算方法已被廣泛應(yīng)用并被證明是十分可靠的[19，22，25－29]．

通過振動頻率分析，穩(wěn)定點沒有虛頻，而過渡態(tài)有且只有一個虛頻，且該虛頻的振動方向是沿著反應(yīng)坐標(biāo)方向的．我們還使用了非極性的PCM溶劑化模型（溶劑是介電常數(shù)ε＝5．697的氯苯）來模擬蛋白質(zhì)環(huán)境下活性中心的極化效應(yīng)．

為了得到Cα－H鍵氧化過程的動力學(xué)同位素效應(yīng)（KIE）值，我們還利用通過Gaussian計算得到的頻率數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)的KIE計算，計算主要基于以下兩個方程[30]，第一個是半經(jīng)驗的Eyring方程，KIE表示為：

其中，k代表反應(yīng)速率常數(shù)，G代表反應(yīng)Gibbs自由能，R代表氣體常數(shù)，T代表絕對溫度，下標(biāo)s代表了該KIE值是半經(jīng)驗值．第二個表達(dá)式通過將半經(jīng)驗的 （kH／kD）s與 Wigner量子校正Qcorr因子相乘做了簡單的量子化校正，KIE表示為：

其中ut＝hνH／kBT，＝hνD＇／kBT，ν為過渡態(tài)的虛頻值，下標(biāo)w代表了該KIE值為Wigner校正值．

3 結(jié)果與討論

3．1 P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應(yīng)

如圖2所示，與P450催化的其它反應(yīng)一樣，環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應(yīng)也是在由兩個簡并的Cpd I基態(tài)引起的不同自旋態(tài)上進(jìn)行的．反應(yīng)物階段（RC），在氣相環(huán)境（E1）和溶劑化環(huán)境（E2）下，四重態(tài)和二重態(tài)是簡并的，能差均為0．2kcal／mol．到了過渡態(tài)階段（TS），氣相下四重態(tài)和二重態(tài)的反應(yīng)能壘分別達(dá)到了5．9kcal／mol和5．5 kcal／mol，其能差仍然很小，僅為0．4kcal／mol；而在溶劑化環(huán)境中，其反應(yīng)能壘分別增加到了7．7 kcal／mol和 6．1kcal／mol，能差被擴(kuò)大至 1．6 kcal／mol．接下來的氧反彈過程是一個無壘過程，生成了初級產(chǎn)物1－羥基－環(huán)己胺以及弛豫態(tài)的Cpd I，整個過程是一個高放熱過程，在氣相環(huán)境下，四重態(tài)和二重態(tài)的能量分別下降到-60．0kcal／mol和-60．1kcal／mol，有趣的是，能差僅為0．1kcal／mol，這說明整個反應(yīng)過程符合Shaik提出的“雙態(tài)反應(yīng)”（TSR）機(jī)理[21，31－32]．

圖2 四、二重態(tài)下P450催化環(huán)己胺Ca－H鍵氧化反應(yīng)的能量過程圖（kcal／mol）．括號外為E1計算水平下的相對能量，括號內(nèi)為E2計算水平下的相對能量．所有數(shù)據(jù)都包含了零點能校正．Fig．2 Energy profile（in kcal／mol）for the Cα－H bond oxidation of cyclohexylamine catalyzed by P450on the quartet and doublet states．Relative energies at the E1level are given out of the parentheses and those at the E2level are given in parentheses．All data include ZPE correction．

如圖3所示，在過渡態(tài)階段，沿著反應(yīng)方向，四重態(tài)中C-H的距離為1．235?，H-O的距離為1．369?，二重態(tài)中C-H的距離為1．185?，H-O的距離為1．472?，相比之下，四重態(tài)的過渡態(tài)更加對稱，并且由于四重態(tài)的C-H距離大于二重態(tài)的C-H距離，所以四重態(tài)的過渡態(tài)相比二重態(tài)更“晚”一點．但是，通過對比反應(yīng)方向上C-H-O的角度可以發(fā)現(xiàn)，四重態(tài)的C-H-O部分更彎曲，其線性關(guān)系并不如二重態(tài)的好．

圖3 Ca－H鍵氧化反應(yīng)過程中DFT優(yōu)化的四、二重態(tài)過渡態(tài)構(gòu)型．鍵長單位為?．Fig．3 DFT optimized geometries of the transition state on the quartet and doublet states in the Cα－H bond oxidation process．Bond length is in?．

眾所周知，自旋密度是分析電子結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確也是最直觀的方法，因此將P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應(yīng)過程中的自旋密度與電荷在表1中列出．在RC階段，兩個自旋態(tài)下底物上的自旋均基本為零，而Cpd I的鐵－氧部分上積聚了約2個單位的自旋，不同的是，四重態(tài)的卟啉－硫氫部分上積聚約1個單位的自旋而在二重態(tài)的卟啉－硫氫部分上積聚了約-1個單位的自旋．到了TS階段，四重態(tài)底物上的自旋密度約為0．5，同時二重態(tài)底物上的自旋密度約為-0．3；與此同時，Cpd I上卟啉－硫氫部分上的自旋密度也發(fā)生了相應(yīng)的變化，四重態(tài)和二重態(tài)的自旋密度分別約為0．5和-0．5，這說明TS階段涉及了電子從底物向Cpd I卟啉－硫氫部分上傳遞的過程．最后，在PC階段，底物上的自旋密度又變?yōu)榱肆?，而Cpd I上的自旋密度也發(fā)生了相應(yīng)的變化，這同樣也說明在無壘的氧反彈過程中也涉及了電子的傳遞．結(jié)合上述的過渡態(tài)構(gòu)型的相關(guān)信息，整個Cα－H鍵氧化反應(yīng)過程中底物和Cpd I上自旋密度的變化趨勢充分說明，在反應(yīng)的過程中，一個氫原子由底物傳遞到了Cpd I上，是一個HAT機(jī)理．

表1 四、二重態(tài)下P450催化環(huán)己胺Ca－H鍵氧化反應(yīng)的自旋密度與電荷Table 1 Spin densities and charges of the Cα－H bond oxidation of cyclohexylamine on quartet and doublet states catalyzed by P450

表2中，四重態(tài)的KIE值為4．9（5．5），略高于二重態(tài)的4．1（5．0），較大的 KIE值也與 Miwa和Kurebayshi等人提出的HAT過程具有較大KIE值的特征相吻合，支持了HAT機(jī)理．結(jié)合上述TS構(gòu)型相關(guān)信息可以看出，KIE值的大小與過渡態(tài)的的對稱性是成比例的：四重態(tài)的C-H距離為1．235?，明顯長于二重態(tài)的1．185?，其過渡態(tài)較之二重態(tài)也更“晚”，其KIE值也相應(yīng)的更大．四重態(tài)下過渡態(tài)的對稱性雖明顯好于二重態(tài)，但其KIE值的差異并不大，我們認(rèn)為這是由于四重態(tài)下過渡態(tài)反應(yīng)方向上C-H-O部分更彎曲，其線性關(guān)系并沒有二重態(tài)好．

2．2 非酶環(huán)境下的1－羥基－環(huán)己胺分解過程

在P450催化環(huán)己胺生成初級產(chǎn)物1－羥基－環(huán)己胺之后，接下來的分解過程是在非酶環(huán)境中通過一個水分子的輔助進(jìn)行的．從圖4中可以看出，1－羥基－環(huán)己胺的分解過程能壘較高，分別達(dá)到了17．0kcal／mol和 13．7kcal／mol，而 產(chǎn) 物 階 段（PC）的能量并沒有下降很多，分別為-6．0kcal／mol和-6．9kcal／mol，可以看出整個分解過程放熱并不強(qiáng)烈．

表2 B3LYP／B1計算水平下P450催化環(huán)己胺Cα－H鍵氧化反應(yīng)過程的內(nèi)稟動力學(xué)同位素效應(yīng)值Table 2 Calculated intrinsic KIE values for the Cα－H bond oxidation process of cyclohexylamine catalyzed by P450at the B3LYP／B1level

圖4 非酶環(huán)境下1-羥基－環(huán)己胺水分子輔助分解過程的能量過程圖（kcal／mol）．括號外為E1計算水平下的相對能量，括號內(nèi)為E2計算水平下的相對能量．所有數(shù)據(jù)都包含了零點能校正．Fig．4 Energy profile（in kcal／mol）for the decomposition of 1-hydroxycyclohexylamine assisted bya water molecule in nonenzymatic environment．Relative energies at the E1level are given out of the parentheses and those at the E2level are given in parentheses．All data include ZPE correction．

圖5 非酶環(huán)境下1-羥基－環(huán)己胺水分子輔助分解過程中DFT優(yōu)化的關(guān)鍵中間體構(gòu)型．鍵長單位為?．Fig．5 DFT optimized geometries of the key intermediates in the decomposition process of 1-hydroxycyclohexylamine assisted by one water molecule in the nonenzymatic environment．Bond length is in?．

圖5給出了1－羥基－環(huán)己胺分解過程過渡態(tài)的構(gòu)型信息．水分子在整個分解過程中充當(dāng)了氫原子傳遞的“shuttle”，將羥基上的氫原子“傳遞”到了氨基上，使得1-羥基－環(huán)己胺分解為環(huán)己酮和氨氣．并且從過渡態(tài)的構(gòu)型可以看出，1-羥基－環(huán)己胺的分解過程是一個協(xié)同的過程．

4 結(jié) 論

在P450細(xì)胞色素蛋白酶催化的一系列二級胺、三級胺的脫烷基、脫氨基反應(yīng)中，環(huán)己胺的脫氨基反應(yīng)因其在生物體代謝過程中的重要地位而倍受關(guān)注．該反應(yīng)中涉及Cα－H鍵氧化過程的機(jī)理在一直倍受爭議，為了明確其機(jī)理細(xì)節(jié)，本文針對P450催化環(huán)己胺脫氨基反應(yīng)進(jìn)行了一系列的密度泛函理論（DFT）計算，并在此基礎(chǔ)上計算了

Cα－H鍵氧化過程的動力學(xué)同位素效應(yīng)（KIE）．計算結(jié)果顯示，兩個自旋態(tài)的Cα－H鍵氧化反應(yīng)能壘分別為5．9／5．5kcal／mol，符合Shaik提出的“雙態(tài)反應(yīng)”（TSR）機(jī)理，并且通過對該反應(yīng)過程中的過渡態(tài)構(gòu)型以及自旋密度與電荷的分析，證明Cα－

H鍵氧化過程是一個氫原子傳遞過程．同時，動力學(xué)同位素效應(yīng)計算結(jié)果顯示Cα－H鍵氧化過程有著較大的 KIE值（4．1／4．9），符合 HAT機(jī)理的動力學(xué)同位素效應(yīng)特征．此外，通過針對Cα－H鍵氧化反應(yīng)的初級產(chǎn)物的分解過程進(jìn)行了DFT計算，發(fā)現(xiàn)通過一個水分子的輔助，在非酶環(huán)境中整個分解過程放熱并不強(qiáng)烈，并且該過程為一個協(xié)同的過程．

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