杭偉,宋騰飛,段文娟,王曉,耿巖玲,楊丙田,張欽德
(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.山東省分析測試中心,山東 濟(jì)南 250014;
3.濟(jì)南三峰生物工程技術(shù)有限公司,山東 濟(jì)南 251400;4.山東中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,山東煙臺264000)
高速逆流色譜分離純化波棱瓜子中化學(xué)成分
杭偉1,2,宋騰飛1,段文娟2,王曉2,耿巖玲2,楊丙田3,張欽德4*
(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.山東省分析測試中心,山東 濟(jì)南 250014;
3.濟(jì)南三峰生物工程技術(shù)有限公司,山東 濟(jì)南 251400;4.山東中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,山東煙臺264000)
采用高速逆流色譜對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比2:6:3:5)為溶劑,上相為固定相,下相為流動相,流速2mL/min,轉(zhuǎn)速850 r/min,共分離得到2個(gè)高純度化合物,經(jīng)過高效液相色譜檢測,純度均高于95%。該方法簡便、快速、節(jié)省溶劑,可以對波棱瓜子中的化學(xué)成分進(jìn)行快速有效的分離純化。
高速逆流色譜;波棱瓜子;分離純化
波棱瓜子,為葫蘆科一年生攀緣草本植物波棱瓜(Herpetospermum pedunculosum(Ser.)C.B.Clarke)的干燥成熟種子[1],主要分布于我國西藏、云南以及印度、尼泊爾等地。本品性寒、味苦,具有清熱解毒、去火降熱及柔肝的功效,是一種傳統(tǒng)常用藏藥材,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于治療黃疸型傳染性肝炎、膽囊炎、消化不良及赤巴病等[2],目前國內(nèi)外對藏藥波棱瓜子的化學(xué)成分研究相對較少。
高速逆流色譜法(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是一種不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜技術(shù),具有操作簡便、可避免因不可逆吸附而引起的樣品損失等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化當(dāng)中[3-4]。本文首次采用高速逆流色譜對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化,得到了2個(gè)純度大于95%的化合物,并采用質(zhì)譜和核磁共振波譜法鑒定其結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)了對波棱瓜子中化學(xué)成分快速、有效的分離純化。
材料:波棱瓜子在四川康定地區(qū)一帶收集,經(jīng)四川中醫(yī)藥科學(xué)院方青茂研究員鑒定,為葫蘆科一年生攀緣草本植物波棱瓜的干燥成熟種子。
儀器:TBP泵、GS10A型高速逆流色譜儀、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3 mm,分離體積230 mL,β值為0.5~0.8)、3057-11記錄儀、8823B-紫外檢測器;Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測器(PDA),Agilent 1100 Series6320 ion-trap質(zhì)譜儀;Varian INOVA-600核磁共振波譜儀。
試劑:逆流色譜用乙酸乙酯、石油醚、氯仿和甲醇均為分析純,所用水為純凈水;高效液相色譜用甲醇為色譜純,所用水為純凈水。
2.1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物的制備
波棱瓜子藥材5 kg,粉碎后用石油醚回流提取3次,每次2 h,將提取液過濾、合并、減壓濃縮,得石油醚提取物234 g;殘?jiān)^續(xù)用乙酸乙酯回流提取3次,每次2 h,將提取液過濾、合并、減壓濃縮,得到乙酸乙酯提取物185 g。
2.2 HSCCC分離
2.2.1 溶劑體系的配制
本實(shí)驗(yàn)溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比2:6:3:5),配約1.5 L,置于分液漏斗中,振蕩使其完全混合后靜置分層,平衡后將上下兩相體系分開,上相作為固定相,下相作為流動相,分別超聲脫氣5~10 min,備用。稱取波棱瓜子乙酸乙酯提取物200 mg,加入上下相各5 m L,振蕩使其完全溶解,備用。
2.2.2 HSCCC制備分離過程
將溶劑體系中的上相(固定相)以20 mL/min的流速泵入HSCCC分離管內(nèi),待上相充滿分離管后,調(diào)至主機(jī)轉(zhuǎn)速為850 r/min,順時(shí)針旋轉(zhuǎn),待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后,以2 mL/min流速泵入下相(流動相),檢測波長254 nm。當(dāng)流動相從主機(jī)口流出時(shí),體系達(dá)到流體動力學(xué)平衡,再將已準(zhǔn)備好的樣品注入HSCCC儀器內(nèi),采集數(shù)據(jù),根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分。
2.2.3 分配系數(shù)(Kd)的測定
根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的Kd值測定方法[5-6],取波棱瓜子乙酸乙酯提取物樣品置于試管內(nèi),加入上下相各3 m L振蕩,使樣品完全溶解,靜置分層,各取上下相5μL,用高效液相色譜進(jìn)行檢測,上相峰面積為A1,下相峰面積為A2,Kd=A1/A2。
2.3 高效液相色譜條件
C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相A:甲醇,流動相B:水;等度洗脫:0~30 min,60%A,40%B;流速:1 m L/min;檢測波長:255 nm;進(jìn)樣量:5μL,柱溫:室溫。
3.1 HSCCC分離條件優(yōu)化
在高速逆流色譜法分離中,選擇溶劑體系是分離中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),溶劑體系是否合適是由該目標(biāo)化合物在其中的分配系數(shù)Kd來衡量的,對于目標(biāo)化合物適宜的溶劑系統(tǒng)分配系數(shù)應(yīng)在0.5~2之間[7]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)目標(biāo)化合物的極性采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系,因?yàn)檫@個(gè)兩相體系具有較寬的極性范圍以及良好的溶解度。如表1所示,選擇了幾種不同的溶劑系統(tǒng),進(jìn)行Kd值測量。當(dāng)采用體積比為2:6:5:3及2:6:4:4的溶劑體系時(shí),會導(dǎo)致分離的時(shí)間短,達(dá)不到良好的分離效果,難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離純化。采用體積比2:6:2:6的體系時(shí),Kd值偏大,雖然取得了很好的分離效果,但是分離時(shí)間較長,分離效率低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)采用體積比為2:6:3:5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系時(shí),目標(biāo)化合物才能得到比較理想的分離效果,而且分離的時(shí)間較為合適。
表1 目標(biāo)成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)Table 1 Kdof compounds in different solvent system
3.2 HSCCC分離純化結(jié)果
選擇石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比2:6:3:5)體系,按照2.2節(jié)所述的方法對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進(jìn)行HSCCC分離,根據(jù)HSCCC譜圖分別收集,結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過HPLC檢測,分別得到2個(gè)高純度化合物,經(jīng)冷凍干燥,得化合物1為11.4 mg,化合物2為15.7mg。結(jié)果如圖2所示。
圖1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of Herpetospermum pedunculosum seeds ethyl acetate extract
圖2 波棱瓜子乙酸乙酯提取物及各化合物HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of extracts and individual compound from Herpetospermum pedunculosum seeds ethyl acetate extract
3.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定
化合物1:ESI-MS(m/z):551.6[M-H]-.1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:7.60(1H,dd,J=8.4 Hz,1.8 Hz,H-6),7.57(1H,d,1.8 Hz,H-2),6.87(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.81(1H,dd,J=8.4 Hz,1.8 Hz,H-6″),6.77(1H,d,J=8.4 Hz,H-5″),6.60(1H,d,J=1.8 Hz,H-2″),6.19(1H,d,J=2.4 Hz,H-2′),5.69(1H,d,J=2.4 Hz,H-6′),5.20(1H,dd,J=7.8 Hz,4.8 Hz,H-8),4.68(1H,d,J=4.8 Hz,H-7),4.60(1H,d,J=4.8 Hz,H-7′),4.20(3H,m,-OCH3),3.85(2H,m,CH2OH),3.48(2H,s,3-OCH3),3.03(1H,m,H-9′),2.97(1H,m,H-9″).13C-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:199.08(C-7),150.58(C-4),146.96(C-3″),146.71(C-3),146.38(C-3′),145.22(C-4″),142.16(C-1″),132.85(C-1′),132.82(C-1),128.88(C-6),124.22(C-5′),122.27(C-6′),118.94(C-6″),118.09(C-5″),114.25(C-5),114.05(C-2),108.56(C-2″),107.51(C-2′),85.81(C-7′),85.69(C-7″),71.67(C-9′),71.57(C-9″),63.89(CH2OH),56.09(3-OCH3),55.96(3′-OCH3),55.94(3″-OCH3),54.18(C-8″),54.06(C-8′),47.87(C-8).化合物1的ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物1為Herpetrione。
化合物2:ESI-MS(m/z):301.3[M-H]-.1H-NMR(DMSO,600 MHz)δ:10.04(1H,brs,-OH),8.04(1H,s,H-1′),7.60(1H,s,4′),7.07(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),6.95(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),5.78(1H,t,J=2.4 Hz,CH2OH),4.90(2H,d,J=2.4 Hz,CH2OH),3.98(3H,s,2′-OCH3),3.85(3H,s,7-OCH3);13C-NMR(DMSO,600 MHz)δ:160.49(C-2),159.24(C-7),154.25(C-2′),152.82(C-8a),147.05(C-3′),140.08(C-5),128.92(C-4),114.97(C-6),114.52(C-4′),113.61(C-3),111.05(C-4a),109.64(C-1′),101.34(C-8),63.78(CH2OH),56.15(2′-OCH3),56.04(7-OCH3).化合物2的ESIMS、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物2為Herpetolide A。
本文首次采用高速逆流色譜法對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比2:6:3:5)溶劑體系,分離得到2個(gè)化合物,其純度經(jīng)高效液相色譜檢測均高于95%。該方法簡便、快速并節(jié)省溶劑,可以對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進(jìn)行快速有效的分離純化,具有較好的實(shí)用價(jià)值。波棱瓜子化學(xué)成分研究是進(jìn)一步進(jìn)行活性研究及產(chǎn)品開發(fā)的必要步驟,建立相關(guān)成分快速有效的分離純化方法,可以為波棱瓜子資源的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持。
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Separation and purification of chem ical constituents in Herpetospermum pedunculosum seeds by high-speed counter-current chromatography
HANG Wei1,2,SONG Teng-fei1,DUAN W en-juan2,WANG Xiao2,GENG Yan-Iing2,YANG Bing-tian3,ZHANG Qin-de4*
(1.College of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.Shandong Analysis and Test Center,Jinan 250014,China;3.Three peak biological engineering technology Co.Ltd.,Jinan 250014,China;4.Shandong College of Traditional Chinese Medicine,Yantai 264000,China)
We originally employed high speed counter-current chromatog raphy(HSCCC)to separate and purify chemical constituents in ethyl acetate dissolvedHerpetospermum pedunculosumseeds.We separated two high-purity chemical compounds with petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water(volume ratio of 2:6:3:5)as solvent,upper organic stationary phase and lower aqueous mobile phase,flow rate of 2 mL/min and rotation speed of 850 r/min.Their HPLC detected purities were more than 95%.The method is simple,rapid,solvent-saving and can rapidly and effectively separate and purify the chemical constituents inHerpetosperm um pedunculosumseeds.
high-speed counter-current chromatography;Herpetospermum pedunculosum seed;separation and purification
R284.2;O657.7
A
1002-4026(2014)01-0040-05
10.3976/j.issn.1002-4026.2014.01.007
2013-11-18
杭偉(1986-),碩士研究生,研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞帧?/p>
*通訊作者,張欽德,教授,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與中藥資源研究。Email:zhangqinde0929@163.com