動態(tài)超聲輔助萃取與HPLC聯(lián)用測定淫羊藿中黃酮類化合物

張坤，梁秀麗

（中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

動態(tài)超聲輔助萃取與HPLC聯(lián)用測定淫羊藿中黃酮類化合物

張坤，梁秀麗

（中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

建立了動態(tài)超聲輔助萃取與高效液相色譜在線聯(lián)用系統(tǒng)，用于測量淫羊藿中黃酮類化合物。萃取過程在一個(gè)循環(huán)體系中完成，萃取完成后，通過采樣環(huán)采集20 μL萃取液，萃取液被流動相載入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測。4種黃酮類化合物用HPLC-MS區(qū)分，通過比較色譜峰面積選擇優(yōu)化萃取條件。選擇50℃的水浴溫度，50%的乙醇作為萃取劑，萃取劑流速為1.5 mL/min，萃取時(shí)間為8 min，樣品量為15 mg。用該法測量淫羊藿樣品中4種黃酮類化合物，日內(nèi)、日間精密度分別為1.05%～2.05%，0.30%～3.63%（n=6）。淫羊藿中的主要化合物淫羊藿苷的加標(biāo)回收率為95.2%。該方法可用于測量淫羊藿中的黃酮類化合物。

在線動態(tài)超聲輔助萃取；高效液相色譜；淫羊藿；黃酮

淫羊藿（ Epimedium Kor eamum Nakai）別名仙靈脾，為小檗科淫羊藿屬（family berberidaceae）植物［1］，是中國傳統(tǒng)的益補(bǔ)中藥，性溫，味甘辛，歸肝、腎經(jīng)，臨床上常用于陽痿遺精，筋骨酸軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣以及慢性氣管炎、神經(jīng)衰弱和心腦血管疾病等癥［2-3］?，F(xiàn)代研究表明其有效成分主要為淫羊藿苷、總黃酮及多糖。文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷的萃取工藝有回流法［4-7］、索氏提取法［8］，這兩種方法所需樣品及萃取溶劑量較大，且需要較長的萃取時(shí)間。目前，一些新的方法被引用到淫羊藿的萃取中。Liu［9］等用高壓密閉微波法、常壓微波法、超聲法、回流法萃取淫羊藿中黃酮類化合物，其中高壓密閉法得到的萃取率最高，但是有些化合物在高溫、高壓條件下易降解。姜寧［10］等采用加速溶劑萃取系統(tǒng)進(jìn)行淫羊藿中淫羊藿苷的快速萃取及測定，萃取時(shí)間為20 min，萃取率為93.15%。

動態(tài)萃取是最近才提出的一種嶄新的方法，這種技術(shù)是基于流動的萃取溶液連續(xù)地通過固體基質(zhì)將目標(biāo)物質(zhì)萃取出來，動態(tài)萃取最早應(yīng)用于沉積物和土壤樣品中重金屬的萃取。近年來，動態(tài)萃取技術(shù)正逐步引起人們的重視。陳立鋼［11］等采用動態(tài)微波輔助萃取的方法萃取淫羊藿中的黃酮類化合物，其產(chǎn)率高于索氏萃取和回流萃取。

筆者采用動態(tài)超聲輔助萃取與高效液相色譜聯(lián)用的方法測定淫羊藿中4種黃酮類化合物，具有分析時(shí)間短、樣品用量小等優(yōu)點(diǎn)，而且在線過濾及在線測量系統(tǒng)的設(shè)計(jì)減少了萃取劑的用量，降低了萃取劑對環(huán)境的危害，也降低了實(shí)驗(yàn)人員與萃取劑接觸的可能性。該方法可用于測定淫羊藿中的淫羊藿苷及朝藿苷A，B，C的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ailgent 1100型，美國Agilent公司；

萃取池：玻璃制品，為自行設(shè)計(jì)加工，長度為60.0 mm，內(nèi)徑為3.0 mm；

超聲波清洗器：KQ-800KDE型，功率為100 W，昆山超聲儀器有限公司；

蠕動泵：FI-2100型，北京海光儀器公司；

紫外分光光度計(jì)：GBC Cintra 10e型，澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司；

質(zhì)譜儀：ABI Q-Trap型，電噴霧離子源，Analyst 1.4 數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢驗(yàn)所；

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后用甲醇稀釋至不同濃度，保存于冰箱中；

淫羊藿樣品：市售，用粉碎機(jī)粉碎，過0.38 mm（40目）篩后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動態(tài)超聲輔助萃?。―UAE）

自行組裝動態(tài)超聲輔助萃取裝置。準(zhǔn)確稱取一定量的淫羊藿樣品置于玻璃制成的萃取池中，樣品兩端用玻璃棉堵住，然后用塞子密封，將萃取池固定在超聲清洗器中，量取5 mL乙醇溶液于儲存瓶中，開啟蠕動泵，儲存瓶中的萃取液被蠕動泵泵出，流經(jīng)萃取池，打開超聲清洗器，萃取劑在管路中循環(huán)流動。與此同時(shí)，開啟液相色譜的高壓泵，建立色譜基線。萃取經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，轉(zhuǎn)換六通閥，萃取劑通過在線過濾被蠕動泵泵到液相色譜20 μL的取樣環(huán)中，之后轉(zhuǎn)換進(jìn)樣閥，取樣環(huán)中的萃取液被流動相載入色譜柱進(jìn)行分離。

1.2.2 靜態(tài)超聲輔助萃?。║AE）

準(zhǔn)確稱取0.5 g淫羊藿樣品于錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，標(biāo)記刻度，將錐形瓶放在超聲清洗器中超聲萃取1 h，然后向錐形瓶中加50%乙醇溶液至標(biāo)線，過濾萃取液，取3 mL溶液，用50%乙醇定容于10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣量20 μL，用HPLC分析。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

氣簾氣和霧化氣：均為N2，壓力為0.21 MPa（30 psi）；噴霧電壓：5 000 V；解簇電壓：120 V；入口電壓：10 V；碰撞能量：10 eV。

1.4 總黃酮量的測定

用紫外可見分光光度計(jì)測定淫羊藿中總黃酮的含量，檢測波長為270 nm，以不同濃度的淫羊藿甘標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的紫外吸收峰峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為1.24～9.92 μg/mL，線性回歸方程為Y=0.055 66X-0.013 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。每次實(shí)驗(yàn)測定均取1 mL 萃取液，用萃取溶劑稀釋至10 mL，得到適當(dāng)?shù)淖贤馕舛取?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC/MS分離鑒別4種黃酮類化合物

淫羊藿萃取物的色譜圖如圖1所示，對應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。根據(jù)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［9，11］可判定，液相色譜圖上的4個(gè)色譜峰對應(yīng)的化合物分別是朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷。

圖1 淫羊藿萃取物的色譜圖

2.2 萃取條件的優(yōu)化

基于現(xiàn)場實(shí)際條件，山路崎嶇不平，路段狹窄，不適合板狀天線的推進(jìn)，因此選擇適應(yīng)山坡路段的蛇形軟質(zhì)天線，即超強(qiáng)地面耦合天線(RTA50 MHz)執(zhí)行本次勘探任務(wù)。雷達(dá)測線按垂直于坡體等高線方向單向布置，測線方向由坡腳向坡頂行進(jìn)，測線覆蓋整個(gè)滑坡區(qū)域，在測線的起始處沿測線方向均向外延伸5～10 m，以便進(jìn)行比對分析。在滑坡后壁處，測線向后壁上方繼續(xù)行進(jìn)5～10 m，以便對滑坡整體機(jī)制做出合理推測和解釋。本文在所有探測結(jié)果中，主要選擇一條有代表性的探測剖面進(jìn)行分析解譯。測線布置圖如上圖2所示。

2.2.1 萃取劑的選擇

將乙醇配成不同濃度的溶液作為萃取劑，體積分?jǐn)?shù)范圍為30%～70%，梯度為10%。稱取10 mg淫羊藿樣品，設(shè)定超聲清洗器水浴溫度為30℃，萃取劑流量為1.0 mL/min，萃取時(shí)間為10 min。在低濃度時(shí)，乙醇濃度與4種黃酮類化合物的萃取率成正比；乙醇濃度越高，萃取率越大；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，萃取率最大，隨后萃取率下降。實(shí)驗(yàn)選擇50%的乙醇作為萃取劑。

表1 淫羊藿萃取物中4種黃酮類化合物的質(zhì)譜碎片

2.2.2 超聲萃取水浴溫度的影響

稱取10 mg淫羊藿樣品，改變水浴溫度，溫度范圍為20～80℃，溫度梯度為10℃，以50%的乙醇作為萃取劑，萃取劑流量為1.0 mL/min ，萃取時(shí)間為10 min。水浴溫度對4種黃酮類化合物的萃取率影響不大，當(dāng)水浴溫度高于60℃時(shí)，朝藿苷C 的萃取率略有下降。實(shí)驗(yàn)選擇50℃的水浴溫度。

2.2.3 萃取劑流量的選擇

稱取10 mg淫羊藿樣品，以50%的乙醇作為萃取劑，在超聲萃取的水浴溫度為50℃，萃取時(shí)間為10 min的條件下進(jìn)行萃取，考察萃取劑流速對4種黃酮類化合物色譜峰面積的影響，流量范圍為1.0～3.0 mL/min，梯度為0.5 mL/min，萃取劑流速對4種黃酮類化合物的產(chǎn)率影響不大。實(shí)驗(yàn)選擇萃取劑流量為1.5 mL/min。

2.2.4 萃取時(shí)間的選擇

稱取10 mg淫羊藿樣品，以50%乙醇作萃取劑，超聲水浴溫度為50℃，萃取劑流量為1.5 mL/min。改變萃取時(shí)間，考察萃取時(shí)間對萃取率的影響，萃取時(shí)間由1～12 min，每隔1 min試驗(yàn)一次。結(jié)果表明待測物的萃取率隨著超聲萃取時(shí)間的增大而增大，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)6 min時(shí)，萃取率不再發(fā)生明顯變化。實(shí)驗(yàn)選擇樣品萃取時(shí)間為8 min，以保證待測物的完全萃取。

2.2.5 樣品量的影響

改變樣品量，以50%的乙醇作為萃取劑，超聲水浴溫度為50℃，萃取劑流量為1.5 mL/min，萃取時(shí)間8 min，測得4種黃酮類化合物的峰面積列于表2。由表2可知，在動態(tài)超聲輔助萃取中，樣品量的大小對待測物萃取率的影響較小。實(shí)驗(yàn)選擇樣品量為15 mg。

表2 不同樣品量4種黃酮類化合物的色譜峰面積

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

取不同濃度的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次進(jìn)樣，在選定的HPLC條件下，以溶液的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度在1.6～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A=31.3c-15.19，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

測定淫羊藿中總黃酮的含量，以不同濃度的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的紫外吸收峰峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為1.24～9.92 μg/mL，線性回歸方程為A=0.055 66c-0.013 68，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。表明在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

在1 d內(nèi)連續(xù)分析6個(gè)淫羊藿樣品，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積測定數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積的日內(nèi)精密度分別為1.05%，1.75%，2.05%，1.85%。每天分析一個(gè)樣品，連續(xù)分析6 d，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積測定數(shù)據(jù)見表4。由表4可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷日間精密度分別為0.97%，0.30%，2.78%，3.63%。

表3 日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取淫羊藿樣品15 mg 3份，分別加入1.0mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，室溫下放置24 h后，按1.2實(shí)驗(yàn)方法萃取樣品，淫羊藿苷回收試驗(yàn)結(jié)果列于表5。由表5可知，淫羊藿苷加標(biāo)回收率為95.2%。

表5 淫羊藿苷加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 比對試驗(yàn)

取不同產(chǎn)地的淫羊藿樣品（樣品1、樣品2、樣品3的產(chǎn)地分別為吉林、安徽、河北），分別用動態(tài)超聲輔助萃?。―UAE）法和藥典方法（UAE）比較，結(jié)果見表6。由表6可知，動態(tài)超聲輔助萃取法和藥典方法萃取率相當(dāng)，但動態(tài)超聲輔助萃取法耗時(shí)短，樣品和萃取劑用量少，操作簡單。

表6 比對試驗(yàn)色譜峰面積 pA·s

2.6 淫羊藿苷和總黃酮的含量

對淫羊藿質(zhì)量的評價(jià)大多以淫羊藿苷或總黃酮含量為指標(biāo)，分別用動態(tài)超聲輔助萃取法和藥典方法對不同產(chǎn)地的淫羊藿樣品進(jìn)行萃取處理，然后測定樣品中淫羊藿苷和總黃酮的含量，測定結(jié)果見表7。

由表7數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)地的淫羊藿中淫羊藿苷的含量明顯不同，總黃酮含量則相差不多。

表7 不同產(chǎn)地淫羊藿中淫羊藿苷和總黃酮的含量 mg/g

3 結(jié)語

用動態(tài)超聲輔助萃取法萃取淫羊藿中朝霍苷A、朝霍苷B、朝霍苷C和淫羊藿苷，與藥典中規(guī)定的方法得到了相似的萃取率，而本方法使用的萃取劑用量少，耗時(shí)短。該法與高效液相色譜在線聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對淫羊藿的在線萃取、分離和檢測，減少了樣品損失，簡化了整個(gè)分析過程。

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內(nèi)蒙廢止18項(xiàng)食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)

4月10日，內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布2014年第6號公告稱，決定對18個(gè)食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)予以廢止，2個(gè)食品地方標(biāo)準(zhǔn)保留并進(jìn)行修訂。

18個(gè)廢止的食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)名稱是：鮮綠蘆筍，牛奶蒸餾酒，沙棘籽油中亞油酸與亞麻酸的測定（氣相色譜法），內(nèi)蒙古優(yōu)質(zhì)無公害大米，發(fā)酵性奶酒，食用沙棘籽油，食用沙棘果汁油，蒸制類面食品，非發(fā)酵豆制品，蕎麥米(仁)檢驗(yàn)規(guī)程，混糖月餅，乳及乳制品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定（高效液相色譜法），乳及乳制品中黃曲霉毒素M1含量的測定（高效液相色譜法），脫水胡蘿卜片(粒)檢驗(yàn)規(guī)程，鹽漬寶塔菜檢驗(yàn)規(guī)程，糜、黃(大黃米)米，線麻籽油、蓖麻籽油，奶片。2個(gè)保留修訂的食品地方標(biāo)準(zhǔn)名稱是炒米、風(fēng)干牛肉。

（儀器信息網(wǎng)）

Determination of Flavonoids in Epimedium Koreamum Nakai by Dynamic Ultrasonic-assisted Extraction System Coupled with HPLC

Zhang Kun， Liang Xiuli
(CNGC Institue 53， Jinan 250031， China)

The dynamic ultrasonic-assisted extraction (DUAE) system coupled with HPLC was used for determination of four flavonoids in epimedium koreamum nakai. The extraction was performed in a recirculating system. When the extraction was completed, the extract (20 μL) was driven to the analytical column by mobile phase and measured by a UV detector. The four flavonoids were identified by HPLC-MS. The extraction parameters of the procedure were optimized by comparison with the peak areas of HPLC. The extraction temperature was 50℃in water bath, the extract solvent was 50% ethanol, the extractant flow rate was 1.5 mL/min, the extraction time was 8 min, and the quantity of the sample was 15 mg. Four flavonoids were measured by the method, the RSD of intra-day and inter-day were 1.05%-2.05% and 0.30%-3.63% (n=6), respectively. The method was applied to determine icariin which was major component in the herb, and the added recovery was 95.2%. The method was successfully applied to the determination of flavonoids in epimedium koreamum nakai.

on-line dynamic ultrasonic-assisted extraction; HPLC; epimedium koreamum naka; flavonoids

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0053-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.015

聯(lián)系人：張坤；E-mail: zhangkun8185@163.com

2014-04-10