香連化滯片質(zhì)量標準的研究*

張 茉，周 軍，李文艷

(1.天津市藥品檢驗所，天津300070;2.天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司，天津300232)

香連化滯片質(zhì)量標準的研究*

張 茉1，周 軍1，李文艷2

(1.天津市藥品檢驗所，天津300070;2.天津隆順榕發(fā)展制藥有限公司，天津300232)

目的:完善香連化滯片的質(zhì)量控制方法。方法:采用薄層色譜方法鑒別香連化滯片中的陳皮、黃連;采用高液相色譜法測定其中芍藥苷和黃芩苷的含量。芍藥苷含量測定色譜條件:采用Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以70%乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，檢測波長230 nm;黃芩含量測定色譜條件:采用phenomenex luna－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)為流動相，檢測波長276 nm。結(jié)果:在選定的薄層色譜條件下，層析斑點清楚，分離效果較好;HPLC方法學考查顯示芍藥苷在0.011 73～2.932 0 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9)，平均加樣回收率為99.06%(n=6)，RSD為0.71%;黃芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9)，平均加樣回收率為98.82%(n=6)，RSD為0.70%。結(jié)論:該方法快捷、準確，可作為該制劑的質(zhì)量控制標準。

香連化滯片，薄層色譜法，高效液相色譜法，芍藥苷，黃芩苷

香連化滯片由白芍、當歸、黃芩、陳皮、黃連等12味中藥組成，具有調(diào)中化滯，止痛止痢的功效，用于紅白痢疾，里急后重，肚腹絞痛，停滯不消。其原標準收載于衛(wèi)生部《藥品標準中藥成方制劑第十五冊》，標準號為WS3－B－2937－98。在2010—2011年度國家藥品標準提高工作中，對其質(zhì)量標準進行了提高和完善。在原標準基礎上，增加了陳皮的薄層鑒別方法，修訂了黃連的薄層鑒別;增加了芍藥苷和黃芩苷的含量測定方法。修訂后的質(zhì)量標準提高了藥品的質(zhì)量控制指標，可更好的控制香連化滯片的產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC－20AD高效液相色譜儀，LC－So-lution工作站。黃連對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號913－9905)，陳皮對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，120969－200808)，芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110736－201136，供含量測定用，純度96.0%)，黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110715－201117，供含量測定用，純度91.7%)。香連化滯片樣品為國內(nèi)某企業(yè)生產(chǎn)(批號為110406、110508、110509、110717)。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取樣品粉末2 g，加甲醇40 ml，超聲處理40 min，濾過，取濾液1 ml備用，剩余濾液蒸干，殘渣加水25 ml使溶解，加乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，加水洗滌2次，每次20 ml，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備取陳皮對照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材2 g(因處方中陳皮、青皮、枳實同時含橙皮苷等黃酮類成分，因此采用缺陳皮、青皮、枳實陰性對照)，按照供試品項下的方法提取，以缺陳皮、青皮、枳實的樣品溶液為陰性樣品溶液1，以缺青皮、枳實的樣品溶液為陰性樣品溶液2。

2.1.4 薄層色譜條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液各2～4 μl，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯(1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2 黃連的薄層色譜

2.2.1 供試品溶液的制備取“2.1.1”項下備用的甲醇提取液作為供試品溶液。

2.2.2 對照藥材溶液的制備取黃連對照藥材0.25 g，加甲醇25 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材2 g(黃連除外)，按照供試品項下的方法提取，作為陰性對照溶液。

2.2.4 薄層條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液各1～2 μl，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，置用濃氨試液飽和10 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈下(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。見圖2。

圖1 陳皮薄層色譜圖

圖2 黃連薄層色譜圖

表1 芍藥苷梯度洗脫系統(tǒng)

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以70%乙腈為流動相A，水為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫;柱溫30℃;流速1.0 ml/min;檢測波長230 nm;理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于5 000。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 ml中含22 μg的溶液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液的制備取樣品(批號110508)適量，研細，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，置水浴上加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心5 min (3 000 r/min)，取上清液，濾過(0.45 μm微孔濾膜)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 陰性對照溶液的制備按處方取除白芍的各味藥材，按制法制得樣品，再按“2.3.2.2”供試品溶液的制備方法，制得白芍陰性對照溶液。

2.3.3 陰性對照試驗精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品中所含其他藥材和輔料，均不干擾芍藥苷的測定。見圖3。

圖3 對照品(A)供試品(B)陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.3.4 線性關系考查取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為每1 ml中含芍藥苷分別為1.173 0、5.865 0、11.730 0、29.320 0、146.600 0和293.200 0 μg的對照品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程: Y=－4 048.91+1 477 587.37 X(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，芍藥苷在0.011 73～2.932 0 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5 重復性試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，共取6份，精密加入70%甲醇25 ml，按“2.3.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，依“2.3.1”項下色譜條件分析，樣品中芍藥苷含量平均值為2.781 0 mg/g，RSD為1.15%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.3.6 精密度試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，按“2.3.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測定芍藥苷峰面積，樣品中芍藥苷峰面積平均值為341 654，RSD為0.95%(n=6)。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.3.1”項下色譜條件分析，分別在0、2、4、8、12、18和24 h進樣測定1次，測得樣品中芍藥苷峰面積平均值為339 708，RSD為1.16%(n=7)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 回收率試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入濃度為0.011 727 mg/ml的芍藥苷對照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分析。結(jié)果芍藥苷平均加樣回收率為99.06%，RSD為0.71%(n=6)。結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(n=6)

2.3.9 樣品測定取同一廠家4個不同批號的樣品，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.3.1”項下色譜條件分析，測定樣品中芍藥苷含量。結(jié)果見表3。

2.4 黃芩苷含量測定

2.4.1 色譜條件phenomenex Luna C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色譜柱;以甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.1)為流動相;柱溫30℃;流速1.0 ml/min;檢測波長276 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應不低于5 000。

表3 芍藥苷樣品含量測定

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對照品溶液的制備取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含黃芩苷24 μg的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液的制備取“2.3.2.2”項下的供試品溶液，即得。

2.4.2.3 陰性對照溶液的制備按處方取除黃芩的各味藥材，按制法制得樣品，再按“2.3.2.2”供試品溶液制備方法，制得黃芩陰性樣品溶液。

2.4.3 陰性對照試驗精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品中所含其他藥材和輔料均不干擾黃芩苷的測定。見圖4。

2.4.4 線性關系考查取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為每1 ml中含黃芩苷分別為2.231 6、11.158 0、22.316 0、55.790 0、278.950 0和557.900 0 μg的對照品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項下色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程:Y= 11 818.28+3 980 910.54 X(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，黃芩苷在0.022 316～5.579 0 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.5 重復性試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，共取6份，分別精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項下色譜條件分析，樣品中黃芩苷含量平均值為5.605 5 mg/g，RSD為0.45%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.4.6 精密度試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，按“2.4.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測定黃芩苷峰面積，樣品中黃芩苷峰面積平均值為895 498，RSD為1.11%(n=6)。

圖4 對照品(A)供試品(B)陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.4.7 穩(wěn)定性試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 ml，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18和24 h進樣，測定，樣品中黃芩苷峰面積平均值為903 570，RSD為0.60% (n=7)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 回收率試驗取同一批號(110508)樣品適量，研細，取0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入濃度為0.022 316 mg/ml的黃芩苷對照品70%甲醇溶液25 ml，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分析。結(jié)果黃芩苷平均加樣回收率為98.82%，RSD為0.70%(n=6)。結(jié)果見表4。

表4 黃芩苷回收率試驗

2.4.9 樣品測定取同一廠家4個不同批號的樣品，按照“2.3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項下色譜條件分析，測定樣品中黃芩苷含量。結(jié)果見表5。

表5 黃芩苷樣品含量測定

3 討論

3.1 陳皮揮發(fā)油鑒別方法的探索

3.1.1 供試品溶液的制備取樣品粉末5 g，加石油醚(30～60℃)30 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液低溫蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液。

3.1.2 對照藥材溶液的制備取陳皮對照藥材0.5 g，按“3.1.1”項下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。

3.1.3 陰性樣品溶液的制備按處方配比，取處方藥材5 g(陳皮除外)，按照供試品項下的方法提取，作為陰性對照溶液。

3.1.4 薄層條件及結(jié)果照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述三種溶液各2～6 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，分別以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(20∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(9∶1)、石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，均噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與陳皮對照藥材色譜相應的位置上未見同顏色的斑點。見圖5。這可能是由于揮發(fā)性成分在樣品儲藏過程中易損失，故此鑒別方法未列入質(zhì)量標準。

3.2 原質(zhì)量標準中，以鹽酸小檗堿對照品鑒別制劑中的黃連，專屬性不強，不能排除樣品中直接添加鹽酸小檗堿的可能性。經(jīng)過試驗，改用黃連對照藥材控制中的黃連，更具有專屬性。故將此項鑒別改為以黃連藥材為對照，作為樣品中黃連的控制手段更為合理。

圖5 陳皮揮發(fā)油薄層色譜圖

3.3 質(zhì)量標準中，芍藥苷和黃芩苷的含量測定試驗共用一份樣品溶液，既節(jié)省了樣品的取樣量，又節(jié)省了試劑和提取操作時間，環(huán)保經(jīng)濟。

R927.11

A

1006－5687(2014)01－0010－05

2013-08-16