吉林曬煙多酚類物質(zhì)及其相關酶活性的變化動態(tài)

孟 莉，郭世英，符云鵬*，邱寶平，劉曉旭 ，郭濛 濛，趙曉軍，韓富根

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.紅塔遼寧煙草有限責任公司，沈陽 110000）

吉林曬煙多酚類物質(zhì)及其相關酶活性的變化動態(tài)

孟 莉1，郭世英2，符云鵬1*，邱寶平2，劉曉旭2 ，郭濛 濛1，趙曉軍1，韓富根1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.紅塔遼寧煙草有限責任公司，沈陽 110000）

選取吉林當?shù)?3 個主栽曬煙品種研究了不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中多酚類物質(zhì)及其相關酶活性的動態(tài)變化以及兩者之間的關系。結(jié)果表明，不同曬煙品種中總酚含量表現(xiàn)為青黃葉＞大葉黃＞大白花，總酚在整個生育期的含量為0.16%～1.2%。不同曬煙品種中總酚含量隨著葉齡的增加而提高，在成熟期稍有降低；青黃葉和大葉黃中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭在葉片發(fā)育過程中整體上表現(xiàn)出上升趨勢，而大白花中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量呈單峰曲線。各品種中苯丙氨酸解氨酶活性與綠原酸和蕓香苷的變化規(guī)律相同，多酚氧化酶活性和過氧化物酶活性呈單峰趨勢。在煙葉生長過程中，各曬煙品種中苯丙氨酸解氨酶活性與綠原酸、蕓香苷、莨菪亭和總酚的變化呈正相關，且與綠原酸和蕓香苷達到顯著水平；多酚氧化酶活性變化與綠原酸、蕓香苷、莨菪葶和總酚的相關性表現(xiàn)為負相關，但未達到顯著水平；過氧化物酶活性與綠原酸、蕓香苷、莨菪葶和總酚呈正相關，且與總酚達顯著水平。由此可見，苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶與多酚類物質(zhì)之間有顯著的相關性，可以通過調(diào)節(jié)這兩種酶的活性來控制多酚的含量，從而改善煙葉質(zhì)量。

多酚類物質(zhì)；苯丙氨酸解氨酶；多酚氧化酶；過氧化物酶

酚類物質(zhì)是植物次生代謝-苯丙烷類代謝途徑的主要產(chǎn)物，在煙草中發(fā)現(xiàn)的酚類物質(zhì)包括單寧類（綠原酸的異構(gòu)體、咖啡酸和奎尼酸）、香豆素類（莨菪亭和莨菪亭的糖苷衍生物）、黃酮類（蕓香苷、黃酮、鼠李糖、黃酮醇）、花色素類（花色素-3-蕓香糖苷、花葵素-3-蕓香苷、堪非醇）、簡單酚衍生物等[1]，其中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭是煙草中最主要的多酚類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)對煙草的生長發(fā)育、調(diào)制特性和調(diào)制后煙葉色澤、商品等級以及煙氣香吃味、生理強度等具有重要影響，是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標之一[2-3]，有人提出以酚類化合物含量與蛋白質(zhì)氮含量的比值作為判斷煙草芳香吃味的依據(jù)[4]，另外酚類代謝在植物的生態(tài)適應性方面具有重要的意義[5]。國內(nèi)外學者就基因型、生態(tài)因素、調(diào)制過程對烤煙多酚類物質(zhì)的影響進行了大量研究[6-8]，關于多酚類物質(zhì)與烤煙質(zhì)量的關系也有不少報道[9-11]，然而對于曬煙這一特色類型多酚類物質(zhì)的相關研究缺乏報道。本文研究了不同曬煙品種多酚類物質(zhì)在生長過程中的積累動態(tài)及其相關酶的活性變化，旨在探討曬煙生長過程中多酚類物質(zhì)的積累機理，為調(diào)控煙草中多酚類物質(zhì)、進一步改善煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地點設在吉林省長春市農(nóng)安縣朝陽溝村，供試曬煙品種為青黃葉、大葉黃和大白花，采用隨機區(qū)組設計，小區(qū)面積 0.02 hm2，重復 3 次。試驗地土壤為油砂土，pH 5.7，有機質(zhì) 15.98 g/kg，堿解氮 140.00 mg/kg，速效磷 17.58 mg/kg，速效鉀 148.83 mg/kg，田間栽培管理措施按照優(yōu)質(zhì)曬煙生產(chǎn)技術規(guī)范進行。

1.2 取樣方法

選取各品種具有代表性煙株的上二棚葉（自下而上第 13、14 位葉），自葉齡 10 d 開始取樣，每隔10 d 取樣 1 次，直至葉片成熟采收，每次各處理取10 片鮮煙葉，3 片經(jīng)液氮速凍后放入-70 ℃的超低溫冰箱中保存用于多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶活性的測定，余下的煙葉在 105 ℃下殺青 15 min，之后于 60 ℃下烘干至恒重保存用于多酚類物質(zhì)的測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 多酚類化合物的測定 多酚類化合物綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量按照 YC/T202—2006 煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的方法測定[12]。總酚含量采用福林試劑法測定[6]。

1.3.2 酶活性的測定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性按照文獻[13]方法測定，多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚氧化法測定[14]，過氧化物酶活性（POD）采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS l9.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 各品種葉片發(fā)育過程中多酚類物質(zhì)含量變化

2.1.1 綠原酸和蕓香苷 由圖1、2 可知，不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中綠原酸和蕓香苷含量呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，在葉齡 10～30 d 呈增加趨勢，之后大白花品種開始減少，而大葉黃和青黃葉品種則繼續(xù)增加。3個品種以大白花煙葉中綠原酸和蕓香苷的含量要遠遠小于青黃葉和大葉黃，大葉黃品種綠原酸和蕓香苷的含量在葉齡 10～30 d 高于青黃葉，在葉齡 30～50 d 時低于青黃葉。

2.1.2 莨菪亭 由圖3 可知，不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中莨菪亭含量整體上呈增加趨勢，且青黃葉＞大葉黃＞大白花，其中青黃葉和大葉黃在葉齡 50 d 時莨菪亭含量達最大值，分別為 0.12 和 0.10 mg/g；大白花在 40 d 時達到最高值為 0.05 mg/g，之后出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。

2.1.3 總酚 由圖4 可知，各品種曬煙中總酚在煙葉生長過程中變化規(guī)律相同，隨著葉齡的增加而增加，大葉黃和青黃葉品種在葉齡 40 d 之后、大白花品種在葉齡 30 d 之后略有下降；總酚含量表現(xiàn)為青黃葉＞大葉黃＞大白花，品種間差異顯著，特別是大白花品種多酚含量要遠遠小于青黃葉和大葉黃，成熟期大白花品種總酚含量穩(wěn)定在 5.0 mg/g 左右，大葉黃和青黃葉穩(wěn)定在 10～12 mg/g，遺傳因素差異可能是造成不同品種曬煙多酚類物質(zhì)含量差異的主要原因。

圖1 不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中綠原酸含量的變化Fig. 1 Dynamic changes of chlorogenic acid during leaf developing of the three varieties

圖2 不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中蕓香苷含量的變化Fig. 2 Dynamic changes of rutin content during leaf developing of the three varieties

圖3 不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中莨菪亭含量的變化Fig. 3 Dynamic changes of scopoletin during leaf developing of the three varieties

圖4 不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中總酚含量的變化Fig. 4 Dynamic changes of total phenols during leaf developing of the three varieties

2.2 各品種葉片發(fā)育過程中與多酚類物質(zhì)相關的主要酶活性的變化

2.2.1 苯丙氨酸解氨酶活性的變化 由圖5 可知，葉片發(fā)育過程中 PAL 活性的變化與綠原酸和蕓香苷的變化一致。不同品種中苯丙氨酸解氨酶的活性差異顯著，青黃葉和大葉黃的 PAL 活性顯著高于大白花。PAL 可以作為植物抗逆境能力的一個生理指標，而大白花在發(fā)育過程中赤星病、蛙眼病、野火病較為嚴重，可能與其葉片 PAL 活性低、煙株的抗病性能差有關。

圖5 苯丙氨酸解氨酶活性的動態(tài)變化Fig. 5 Dynamic changes of phenylalanine ammonia lyase in three varieties of sun-cured tobacco

2.2.2 多酚氧化酶活性的變化 由圖6 可知，隨著葉齡的增加 PPO 活性先上升后下降，在葉齡 30 d（打頂后 10 d）PPO 活性最高；不同品種中 PPO 活性以大白花最高，青黃葉次之，大葉黃最低。

2.2.3 過氧化物酶活性的變化 由圖7 可知，不同品種曬煙 POD 活性的變化規(guī)律一致，即在葉片發(fā)育中 POD 活性逐漸提高，葉齡 40 d 時達到最高值，之后隨著煙葉的衰老成熟稍有下降。不同品種 POD活性表現(xiàn)為：大葉黃＞青黃葉＞大白花，各品種之間的差異在不同時期表現(xiàn)不一致。

2.3 各品種 3 種多酚類物質(zhì)占總酚的比例

由表1可以看出，在煙葉發(fā)育過程中3種酚類物質(zhì)占總酚比例的變化沒有明顯的規(guī)律性。不同品種葉片發(fā)育過程中莨菪亭占總酚的比例最小僅為0.47%～1.71%；綠原酸和蕓香苷占總酚的比例較大，但品種間差異明顯，大葉黃和青黃葉品種綠原酸占總酚比例相對較高，而大白花品種蕓香苷占比例最高。

圖6 不同曬煙品種中多酚氧化酶活性的動態(tài)變化Fig. 6 Dynamic changes of Polyphenol oxidase in different varieties of sun-cured tobacco

圖7 不同曬煙品種中過氧化物酶活性的動態(tài)變化Fig. 7 Dynamic changes of peroxidas in different varieties of sun-cured tobacco

2.4 各品種多酚類物質(zhì)與其相關酶的相關性

由表2知，不同曬煙品種葉片發(fā)育過程中PAL活性與綠原酸、蕓香苷、莨菪亭和總酚含量呈正相關，且與綠原酸和蕓香苷相關性均達顯著水平；PPO活性與綠原酸、蕓香苷、莨菪葶和總酚的含量均為負相關，但沒達到顯著水平；POD活性與綠原酸、蕓香苷、莨菪葶和總酚含量呈正相關，且與總酚的相關性達到顯著水平。

3 討 論

在煙草中發(fā)現(xiàn)的酚類及其衍生物種類繁多，因煙草類型和品種的不同，酚類物質(zhì)含量的變化范圍在 0.4%～6%，研究表明，烤煙 3.58%～4.25%，晾煙 0.029%～0.52%，白肋煙 1.13%～1.75%[6]。酚類物質(zhì)及其衍生物不僅是次生代謝產(chǎn)物，而且有些成分積極參與煙草植株的代謝活動并有著重要的生理意義[16]。多酚類化合物對煙草品質(zhì)最直觀的影響是煙葉的顏色，煙葉調(diào)制過程中，多酚類物質(zhì)容易發(fā)生酶促棕色化反應形成顏色各異的復合色素，對煙葉顏色造成重要影響。另外，多酚類物質(zhì)的降解物能增加煙草的香氣量，對改善煙草制品的品質(zhì)有著重要的作用。已有研究表明，多酚與香氣特征指標的典型相關系數(shù)達到顯著水平，與煙氣特性和口感特性指標的典型相關系數(shù)均達到極顯著水平[17]。一般認為多酚類物質(zhì)的含量與煙葉等級是相一致的，高等級煙葉多酚含量高，等級較好的煙葉中綠原酸和蕓香苷的含量也較高，低等級煙葉多酚含量低[6]。本試驗3個品種中總酚含量表現(xiàn)為青黃葉＞大葉黃＞大白花，大葉黃和青黃葉煙葉中綠原酸含量最高，而大白花煙葉中蕓香苷含量最高，這可能是其在香型風格上相互區(qū)別的重要內(nèi)在物質(zhì)基礎，這與宗浩等[18]研究的結(jié)果相似，但二者是否存在關聯(lián)仍需要進一步驗證。

表1 不同曬煙品種 3 種酚類占總酚的比例 %Table 1 Chlorogenic acid, rutin and scopoletin in the proportion of total phenols in three varieties of sun-cured tobacco

表2 曬煙生長過程中酚類物質(zhì)與其相關酶的相關分析Table 2 Correlation coefficient between polyphenol contents and enzyme activity

在酚類物質(zhì)代謝過程中，需要很多酶的催化，每個酶都有其不同的作用，這些酶及其同工酶的協(xié)同作用，才使得酚類物質(zhì)的代謝活動順利進行。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）是研究較多的與多酚類物質(zhì)代謝密切相關的酶。苯丙氨酸解氨酶是一個可用于酚類合成的限速酶，主要催化由苯丙氨酸到各種酚類的第一步反應，為多種酚類及類黃酮提供前提物質(zhì)[19]。多酚氧化酶是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的含銅金屬酶類，是呼吸鏈末端氧化酶之一，在氧的存在下，兒茶酚、花色素、綠原酸等單酚和多酚，均能被其催化而氧化[20]，且在調(diào)制過程中由于多酚氧化酶的催化會使煙葉發(fā)生棕色化反應。過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶類，主要存在于細胞的過氧化物酶體中，可以催化酚類物質(zhì)的氧化[21]。王愛華等[22]研究表明，增加施氮量會使 PPO活性降低、PAL 活性增強，而且施氮量高的處理其總酚、綠原酸、類黃酮含量較高。馬俊峰[23]研究了硫酸銅對煙葉生長過程中多酚調(diào)控效應及影響，結(jié)果表明噴施硫酸銅增強 PAL、PPO、和 POD 活性，且酚類物質(zhì)顯著提高?？傊?，合理的農(nóng)業(yè)栽培措施可提高煙草中多酚類化合物的含量；而在適宜的調(diào)制、陳化條件下，適當促控多酚的棕色化反應，煙葉可達到理想的色澤。

4 結(jié) 論

不同曬煙品種 PAL 活性和 POD 活性在葉片發(fā)育過程中的動態(tài)變化與綠原酸、蕓香苷、莨菪亭和總酚呈正相關且基本上達到顯著性水平，而 PPO 活性變化與綠原酸、蕓香苷、莨菪葶和總酚的相關性表現(xiàn)為負相關，但未達到顯著。對于上述酶的動力學特性，我們可以優(yōu)化這些酶的可調(diào)控因素，充分利用其在曬煙多酚類物質(zhì)合成中的作用，進而改善煙葉質(zhì)量。

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Dynamic Changes of Polyphenol Contents and Enzyme Relating to Polyphenol Synthesis in Sun-cured Tobacco in Jilin

MENG Li1, GUO Shiying2, FU Yunpeng1*, QIU Baoping2, LIU Xiaoxu2, GUO Mengmeng1, ZHAO Xiaojun1, HAN Fugen1
(1. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Hongta Liaoning Tobacco Co., Ltd., Shenyang 110000, China)

A field experiment was conducted to study the changes of polyphenol contents and enzyme relating to polyphenol synthesis and the relationship between them in three sun-cured tobacco varieties in Jilin. The results showed that the total phenols content Qinghuangye ＞ Dayehuang ＞ Dabaiihua in the three sun-cured tobacco varieties in Jilin, with range 0.16% to 1.2% in the whole growth period. The total phenols increased with increasing leaf age, and decreased slight in late mature. Chlorogenic acid, rutin and scopoletin showed an upward trend during leaf development in Qinghuangye and Dayehuang, but they showed a single peak curve in Dabaihua. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity had the same trend with chlorogenic acid and rutin in all varieties. Polyphenol oxidase (PPO) activity and peroxidase (POD) activity showed a single peak trend. With the growth and development of tobacco leaves, phenylalanine ammonia lyase activity with chlorogenic acid, rutin, scopoletin changes and total phenols were positively correlated, and with chlorogenic acid and rutin was significantly correlated. Peroxidase activity with chlorogenic acid, rutin, scopoletin and total phenols were positively correlated, and with total phenol reached significant levels. There was significant correlation between phenylalanine ammonia lyase, peroxidase and polyphenol contents. We can regulate the activity of two enzymes to control content of polyphenols, then improving the quality of tobacco finally.

polyphenol contents; phenylalanine ammonia lyase; polyphenol oxidase; peroxidase

S572.01

1007-5119（2014）06-0059-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.012

中國煙草實業(yè)發(fā)展中心資助項目（zysy-2010-03）；紅塔遼寧煙草有限責任公司資助項目（20130401）

孟 莉，女，在讀碩士，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：mengli61400@163.com。*通信作者，E-mail：ypfu01@163.com

2014-07-12

2014-09-23