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    mTOR信號通路介導(dǎo)產(chǎn)生XCL1可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖

    2014-06-01 09:18:42
    中國癌癥雜志 2014年10期
    關(guān)鍵詞:趨化因子細(xì)胞株磷酸化

    復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,復(fù)旦大學(xué)乳腺研究所,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海200032

    mTOR信號通路介導(dǎo)產(chǎn)生XCL1可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖

    白玉盤 楊小利 歐周羅

    復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,復(fù)旦大學(xué)乳腺研究所,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海200032

    背景與目的:統(tǒng)計表明90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關(guān),而在乳腺癌中常見PI3K/Akt/ mTOR信號通路的異常激活,以此通路為靶點(diǎn)的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)。本研究主要分析C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1,XCL1)對乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖的影響及其產(chǎn)生機(jī)制。方法:建立吉西他濱耐藥性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/Gem。采用CCK8檢測MDA-MB-231和MDA-MB-231/Gem的增殖能力,RT-PCR、ELISA檢測2株細(xì)胞株XCL1表達(dá)差異,Western blot檢測mTOR的表達(dá)。結(jié)果:與MDA-MB-231相比,MDA-MB-231/ Gem的增殖能力增強(qiáng),XCL1在耐藥細(xì)胞株表達(dá)增強(qiáng)。mTOR在耐藥細(xì)胞株表達(dá)水平及磷酸化水平增強(qiáng)。在MDAMB-231中加入外源性XCL1 24 h后,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。而在MDA-MB-231/Gem中加入抗XCL1抗體后,細(xì)胞增殖能力降低。mTOR抑制劑處理MDA-MB-231/Gem后,細(xì)胞增殖能力降低,XCL1產(chǎn)生減少。結(jié)論:趨化因子XCL1的分泌可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的增殖并由mTOR信號通路介導(dǎo)產(chǎn)生。

    MDA-MB-231/Gem;趨化因子配基1;mTOR;乳腺癌

    惡性腫瘤已成為人類的第一殺手,嚴(yán)重危害人類的生命健康。今后20年內(nèi)全球癌癥患者人數(shù)還將快速上升。目前,化療是治療腫瘤的主要途徑之一,然而腫瘤耐藥往往造成化療失敗,從而導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡[1-2]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關(guān)。因此,如何克服腫瘤耐藥是成功治療惡性腫瘤急需解決的關(guān)鍵問題之一[3]。哺乳動物體內(nèi)的mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可介導(dǎo)多種蛋白如HIF-1α等的產(chǎn)生。mTOR信號通路與人類多種腫瘤密切相關(guān),其在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及對放化療抵抗中發(fā)揮重要作用[4-5],乳腺癌中常見PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活,以此通路為靶點(diǎn)的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)[5-6]。本研究應(yīng)用CCK8、PCR及Western blot等多種實驗方法檢測了乳腺癌細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株中C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1,XCL1)、mTOR的表達(dá),并分析其與細(xì)胞增殖的關(guān)系及耐藥機(jī)制,旨在為乳腺癌臨床治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞及試劑

    1.1.1 細(xì)胞

    化療抵抗乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/ Gemcitabine(MDA-MB-231/Gem)由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所建立。MDA-MB-231及MDA-MB-231/Gem細(xì)胞用DMEM培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%FBS。細(xì)胞傳代時用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶3的比例傳代。

    1.1.2 主要試劑

    重組蛋白XCL1(購自美國R&D公司),mTOR和磷酸化mTOR抗體及mTOR磷酸化抑制劑(購自美國Cell Signaling Technology公司),ELISA試劑盒(購自美國R&D公司),RIPA裂解液(購自中國碧云天公司),PhosStop(購自瑞士Roche公司),BCA蛋白定量試劑盒(購自美國Thermo Scientific Pierce公司),TRIzol(購自美國Invitrogen公司),凋亡試劑盒(購自美國Invitrogen公司)。

    1. 2 主要儀器

    Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)(購自德國Eppendorf公司),精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱(購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司),恒溫金屬浴振蕩器(購自中國博日科技Bioer公司),Bio-Rad恒流恒壓電泳儀(購自美國Bio-Rad公司),ATTO AE-6450電泳槽(購自日本ATTO公司),UV-120-02型紫外分光光度儀(購自日本島津公司),Image quant Las 4000mini凝膠成像儀及Nanoview微量檢測儀(購自美國通用電氣),ESCO classⅡ生物安全柜(購自新加坡ESCO公司), Biotek ELX-800酶標(biāo)儀(購自美國Biotek公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 細(xì)胞總RNA的抽提

    將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去,用預(yù)冷的PBS洗1次,加入1 mL TRIzol(以能完全覆蓋整個細(xì)胞表面為宜),反復(fù)吹打細(xì)胞然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管(EP管)內(nèi),將EP管放入冰盒里靜置5 min后,加入200 μL氯仿,振蕩15 s后,置于冰盒內(nèi)靜置2 min,隨后12 000×g、4 ℃離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi),并加入500 μL異丙醇,輕輕震蕩使管中液體混合均勻,靜置10 min,行12 000×g、4 ℃離心10 min,棄上清液。接著,加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇(用DEPC水配制),輕輕洗滌沉淀,行7 500×g、4 ℃離心5 min,棄上清液,沉淀總RNA置室溫風(fēng)干5 min,隨后加入100 μL的DEPC水溶解。最后,用多功能酶標(biāo)儀測定RNA濃度,按照反應(yīng)體系需要,加入各種試劑,放入金屬浴內(nèi)反應(yīng),去除其中的DNA酶。

    1.3.2 RT-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物鑒定

    1.3.2.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

    反應(yīng)體系總體積為20 μL,模板為從乳腺癌細(xì)胞抽提的總RNA。在EP管中分別加入試劑:4 μL 5×PrimeScriptBuffer PrimeScript,1 μL RT Enzyme Mix Ⅰ,1 μL Oligo dT Primer,1 μL Random 6 mers,2 μL RNA,11 μL DEPC H2O,輕輕震蕩使管中液體混合均勻,置于PCR儀(EppendofMastercycler pro S)內(nèi),根據(jù)相應(yīng)的反應(yīng)條件,進(jìn)行cDNA合成。

    反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。

    1.3.2.2 PCR反應(yīng)

    反應(yīng)體系總體積為20 μL。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物XCL1序列正義鏈:5’-GCTCTCTCACTGCATACATTGT-3’;反義鏈:5’-AGTCACAGCTGTATTGGTCG-3’。在EP管中分別加入各種反應(yīng)試劑:2 μL 10×PCR Buffer,1.6 μL dNTP Mix,上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL,2 μL cDNA,14.5 μL H2O,輕輕震蕩使管中液體混合均勻,置于PCR儀內(nèi),并根據(jù)相應(yīng)的反應(yīng)條件,進(jìn)行PCR反應(yīng)。

    1.3.2.3 產(chǎn)物驗證

    取1.5 g瓊脂糖,加入1×TAE緩沖液150 mL,置于微波爐(Galanz)內(nèi)加熱至完全溶解,倒入裝有梳子的電泳模具中凝固,制備成1%瓊脂糖凝膠。然后,把凝膠放入電泳槽(Biorad)內(nèi),加入1×TE電泳緩沖液,取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物,加入1 μL的6×Loading Buffer,與DNA marker一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,120 V電壓,30 min電泳。電泳結(jié)束后,將瓊脂糖凝膠置于EB染色液中染色10 min,之后在清水內(nèi)清洗10 min,最后利用生物電泳圖像分析系統(tǒng)(復(fù)日科技,F(xiàn)R-980A)觀察并拍照,確認(rèn)特異性目的條帶。

    1.3.3 蛋白免疫印跡雜交

    取對數(shù)生長期細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗3遍后,在培養(yǎng)皿中加入適量PBS液,用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中。然后,200×g,離心半徑140 mm離心5 min,棄上清液,細(xì)胞沉淀中加入適量細(xì)胞裂解液混合均勻,冰上放置10 min,使其充分裂解。接著12 000×g,4 ℃離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中,抽提的總蛋白用BCA法測定濃度,以2 000 μg/mL為標(biāo)準(zhǔn),稀釋各個樣品,按照40 μg/孔上樣,即每孔的上樣量為20 μL的蛋白和5 μL的5×蛋白Loading Buffer。95 ℃加熱煮沸5 min,使蛋白變性,12 000×g離心1 min。制備12%分離膠(30%聚丙烯酰胺,pH=8.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED)和濃縮膠(30%聚丙烯酰胺,pH=6.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED),放入蛋白電泳槽(Bio-rad)中,加入電泳緩沖液(25 mmol/L Tris,250 mmol/ L 甘氨酸,0.1%SDS)。上樣,接通電源,濃縮膠在80 V電壓條件下,分離膠在120 V電壓條件下進(jìn)行電泳,1.5 h后結(jié)束電泳。加入轉(zhuǎn)膜緩沖液,并放入冰袋,整體置于冰盒內(nèi),接通電源,在90 V電壓下轉(zhuǎn)膜2 h。隨后將PVDF膜浸于5%的牛奶中,封閉1 h。根據(jù)蛋白marker裁剪PVDF膜,加入用一抗稀釋液稀釋的抗體,4 ℃搖床溫育過夜。隔日,用TBST洗膜3次,每次10 min。室溫溫育二抗1 h,隨后用TBST洗膜3次,每次10 min。最后,化學(xué)發(fā)光法顯色。按照SuperSignal West Dura Extended Duration Substrated的產(chǎn)品說明書配制顯色液,加到PVDF膜上,用ImageQuant Las 4000 mini凝膠成像儀檢測特異性條帶。

    1.3.4 細(xì)胞增殖實驗

    將細(xì)胞分別以每孔3 000個細(xì)胞的密度接種于96孔板,每個時間點(diǎn)做5個平行樣本,將培養(yǎng)板在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。分別在0、1、2、3、4、5、6 d上述指定時間向每孔加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度,計算每5孔的吸光度值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,繪制細(xì)胞生長曲線。

    1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測

    細(xì)胞以每孔2×105密度接種于6孔培養(yǎng)板,將細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h后,給予吉西他濱35 μmol/L處理48 h,胰酶消化收集細(xì)胞(培養(yǎng)基上清液一起收集),200×g,離心半徑140 mm,離心5 min。然后細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2遍。用1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/mL。接著,加入5 μL AnnexinV-FITC及1 μL 100 μg/mL的PI工作液,輕輕混勻,避光室溫反應(yīng)15 min。最后,加入1倍結(jié)合緩沖液400 μL,輕輕混勻,用流式細(xì)胞檢測儀器(貝克曼)檢測細(xì)胞凋亡。CXP 2.1軟件分析各個實相的細(xì)胞,至少50 000個細(xì)胞被檢測。

    1.3.6 ELISA實驗

    分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0 pg/mL孔加試劑稀釋液)加入相應(yīng)孔中(100 μL/孔)用封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃溫育90 min。提前準(zhǔn)備好抗體工作液,洗板5次,除空白孔外,加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔),用封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃溫育60 min。提前制備酶結(jié)合物工作液,室溫避光放置。洗板5次,除空白孔外加入酶結(jié)合物液(100 μL/孔),用封板膠紙封住反應(yīng)孔,37 ℃溫育30 min。洗板5次。加入顯色底物(包括空白孔)100 μL/孔,37 ℃避光溫育15 min。加入終止液100 μL/孔,混勻后即刻測量A450值。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 耐藥細(xì)胞株231/Gem的鑒定及特性

    將231和相應(yīng)的231/Gem細(xì)胞按2×105接種于6孔板,并在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,給予吉西他濱35 μmol/L處理,72 h后進(jìn)行凋亡檢測,發(fā)現(xiàn)231/Gem細(xì)胞的凋亡率明顯下降,比231細(xì)胞下降了28.8%,說明231/Gem耐藥性穩(wěn)定(圖 1A)。利用CCK8進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測發(fā)現(xiàn),與231細(xì)胞相比,231/Gem從第4天開始增殖明顯加快即隨著時間的推移其增殖能力明顯增強(qiáng)(圖1B)。

    2.2 耐藥細(xì)胞株231/Gem的增殖特性與XCL1的分泌增加相關(guān)

    圖1 與231相比,231/Gem細(xì)胞凋亡減少(A),隨時間變化增殖能力明顯增強(qiáng)(B)Fig. 1 Apoptosis of 231/Gem was reduced(A) the proliferation of 231/Gem signi fi cantly enhanced over time compare with 231(B)

    本實驗中,為研究趨化因子與吉西他濱耐藥的關(guān)系,從親本細(xì)胞231與建立的吉西他濱耐藥細(xì)胞株231/Gem提取RNA,對趨化因子家族C、CC、CXC、CX3C的代表性趨化因子進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與親本乳腺癌細(xì)胞相比,231/Gem細(xì)胞株中趨化因子XCL1 mRNA表達(dá)水平增高,而其他趨化因子未見分泌增加(圖2AB)。ELISA實驗證實乳腺癌耐藥細(xì)胞株中XCL1蛋白水平顯著增高(圖2C)。為了驗證231/Gem的增殖能力與XCL1相關(guān),我們在親本231細(xì)胞株中加入外源性XCL1的重組蛋白,在231/Gem 細(xì)胞株中加入抗XCL1的抗體,24 h后發(fā)現(xiàn)培液中含XCL1細(xì)胞因子的231細(xì)胞株增殖能力增強(qiáng)(圖2D)。而加入抗XCL1抗體的耐藥細(xì)胞較231/Gem增殖速度減低(圖3A)。這些結(jié)果提示,耐藥細(xì)胞株增殖能力與XCL1的分泌增加相關(guān)。

    2.3 mTOR信號通路的激活促進(jìn)XCL1的分泌

    Western檢測發(fā)現(xiàn),在耐藥細(xì)胞株中mTOR總蛋白表達(dá)水平、mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均比對照組顯著增強(qiáng)(圖3B),提示耐藥細(xì)胞株中mTOR信號通路的激活可能與XCL1的分泌增加相關(guān),為了驗證這一設(shè)想,我們在耐藥細(xì)胞株中加入mTOR的磷酸化抑制劑(100 nmol/L)——雷帕霉素(Rapamycin),其能抑制mTOR的磷酸化,進(jìn)而抑制下游效應(yīng)分子70-KDaS6激酶(P70S6K)的活性,與我們猜測相同的是,耐藥細(xì)胞株中mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均被抑制(圖3C)ELASIA實驗證實耐藥細(xì)胞XCL1分泌下降(圖3D)。這些結(jié)果提示mTOR信號通路的磷酸化促使XCL1的分泌增多,從而使耐藥細(xì)胞株的增殖能力增強(qiáng)。

    圖2 與231相比,231/Gem中XCL1 mRNA表達(dá)(A,B)和蛋白質(zhì)水平(C)均升高,231中加重組XCL1可促細(xì)胞增殖(D)Fig. 2 Comparad to 231, mRNA expression(A, B) and protein level(C) of XCL1 in 231/Gem increased. Recombinant XCL1 promoted 231 proliferation (D)

    圖3 231/Gem中加入抗XCL1抗體可拆抑制細(xì)胞增值(A),231/Gem中mTOR及磷酸化P70S6K水平升高(B),mTOR抑制劑rapamycin可逆轉(zhuǎn)之(C),伴XCL1下調(diào)(D)Fig. 3 Anti-XCL1 reduced 231/Gem proliferation(A). mTOR and p-P70S6K were higher in 231/Gem(B), mTOR inhibitor rapamycin can invert them(C), and down-regulate XCL1(D)

    3 討 論

    乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近10年來,中國主要城市乳腺癌發(fā)病率增加了37%,全國則以3%~4%的水平呈逐年上升趨勢[7]。但是,乳腺癌治療中存在的耐藥問題大大影響了化療藥物的臨床療效,是導(dǎo)致乳腺癌臨床治療失敗的主要原因之一。因此針對這些問題,我們選用業(yè)已建立的耐吉西他濱的乳腺癌細(xì)胞株和親本細(xì)胞株作為研究對象,探討乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖特性及其相關(guān)的機(jī)制。

    我們的實驗結(jié)果顯示與親本乳腺癌細(xì)胞株相比,乳腺癌耐吉西他濱細(xì)胞株的增殖能力明顯增強(qiáng),這一現(xiàn)象與趨化因子XCL1的表達(dá)密不可分。趨化因子是能引起細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子,對機(jī)體的免疫系統(tǒng)非常重要[8]。XCL1亦稱Lymphotactin(Ltn)是C族趨化因子家族的一員,其受體XCR1與XCL1相互作用參與抗原呈遞、激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞,發(fā)揮機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡,增強(qiáng)黏膜免疫、抗腫瘤免疫,在感染性疾病過程中誘發(fā)炎性反應(yīng)等[8-10]。本次實驗首次發(fā)現(xiàn)XCL1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞尤其是耐藥細(xì)胞株的增殖,在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中,我們檢測到XCL1的表達(dá)顯著增高,給予XCL1抗體后耐藥細(xì)胞株的增殖能力明顯下降,說明耐藥細(xì)胞株中XCL1的上調(diào)導(dǎo)致其增殖能力增強(qiáng)。

    TOR基因是 1991年在酵母中作為雷帕霉素的靶蛋白而被發(fā)現(xiàn)的,與酵母 TOR結(jié)構(gòu)和功能相應(yīng)的哺乳動物的TOR稱為mTOR。mTOR被認(rèn)為是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶蛋白質(zhì)家族成員[11],它的主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)的合成,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖[12]。mTOR激酶主要通過2種信號通路調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖:①PI3K/Akt /mTOR通路,Akt可直接磷酸化mTOR的Ser 2448位點(diǎn),激活mTOR和下游途徑,控制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化所需的特殊蛋白質(zhì)的翻譯[13]。②Akt/TSC1-TSC2/mTOR/S6K通路,結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物(TSC)是腫瘤抑制因子,當(dāng)基因發(fā)生突變或缺失時引起細(xì)胞黏附、生長和遷移,可導(dǎo)致大腦及腎臟的結(jié)節(jié)性硬化性損壞。在哺乳動物細(xì)胞中,TSC1-TSC2復(fù)合物是mTOR的抑制因子,因此在TSC1-TSC2復(fù)合物異常的細(xì)胞中,mTOR及下游的效應(yīng)分子被激活,使細(xì)胞無限增殖[12-14]。mTOR的激活可以參與體內(nèi)多條信號通路,影響轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成。本實驗中我們檢測到耐藥細(xì)胞株中mTOR及其活性形式p-mTOR表達(dá)增高,推測可能是mTOR信號通路的激活促使耐藥細(xì)胞株中分泌XCL1增多,從而促進(jìn)耐藥細(xì)胞株的增殖。在耐藥細(xì)胞株中加入mTOR抑制劑后,觀察到XCL1的表達(dá)顯著下降,進(jìn)一步驗證了我們的推測。

    雖然目前對于腫瘤耐藥機(jī)制尤其細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識有限,但有關(guān)研究已經(jīng)或正在為腫瘤治療帶來新的契機(jī)。借助腫瘤分子靶向治療,人們已經(jīng)開始嘗試通過阻斷細(xì)胞中某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制腫瘤的生長、代謝以及腫瘤血管的生成[15-16]。本研究證實mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)產(chǎn)生XCL1可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖,提示趨化因子參與腫瘤耐藥,這將為乳腺癌臨床治療提供新的吧點(diǎn)。

    [1] LI X, LEWIS M T, HUANG J, et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy[J]. J Natl Cancer Inst, 2008, 100(9): 672-679.

    [2] RIVERA E, GOMEZ H. Chemotherapy resistance in metastatic breast cancer: the evolving role of ixabepilone[J]. Breast Cancer Res, 2010, 12 Suppl 2: S2.

    [3] ZHANG M L, HUANG Z Z, ZHENG Y. Estimates and prediction on incidence, mortality and prevalence of breast cancer in China, 2008[J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2012, 33(10): 1049-1051.

    [4] WULLSCHLEGER S, LOEWITH R, HALL M N. TOR signaling in growth and metabolism[J]. Cell, 2006, 124(3): 471-484.

    [5] PORSTMANN T, SANTOS C R, GRIFFITHS B, et al. SREBP activity is regulated by mTORC1 and contributes to Aktdependent cell growth[J]. Cell Metab, 2008, 8(3): 224-236.

    [6] SANTEN R J, SONG R X, ZHANG Z, et al. Adaptive hypersensitivity to estrogen: mechanisms and clinical relevance to aromatase inhibitor therapy in breast cancer treatment[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2005, 95(1-5): 155-165.

    [7] SCHERER L D, UBEL P A, MCCLURE J, et al. Belief in numbers: When and why women disbelieve tailored breast cancer risk statistics[J]. Patient Educ Couns, 2013, 92(2): 253-259.

    [8] KENNEDY J, KELNER G S, KLEYENSTEUBER S, et al. Molecular cloning and functional characterization of human lymphotactin[J]. J Immunol, 1995, 155(1): 203-209.

    [9] KIM M, ROOPER L, XIE J, et al. The lymphotactin receptor is expressed in epithelial ovarian carcinoma and contributes to cell migration and proliferation[J]. Mol Cancer Res, 2012, 10(11): 1419-1429.

    [10] BEYER M, KARBACH J, MALLMANN M R, et al. Cancer vaccine enhanced, non-tumor-reactive CD8(+) T cells exhibit a distinct molecular program associated with “division arrest anergy”[J]. Cancer Res, 2009, 69(10): 4346-4354.

    [11] HELLIWELL S B, WAGNER P, KUNZ J, et al. TOR1 and TOR2 are structurally and functionally similar but not identical phosphatidylinositol kinase homologues in yeast[J]. Mol Biol Cell, 1994, 5(1): 105-118.

    [12] POTTER C J, PEDRAZA L G, XU T. Akt regulates growth by directly phosphorylating Tsc2[J]. Nat Cell Biol, 2002, 4(9): 658-665.

    [13] ROBERTSON G P. Functional and therapeutic significance of Akt deregulation in malignant melanoma[J]. Cancer Metastasis Rev, 2005, 24(2): 273-285.

    [14] ZHANG H, BAJRASZEWSKI N, WU E, et al. PDGFRs are critical for PI3K/Akt activation and negatively regulated by mTOR[J]. J Clin Invest, 2007, 117(3): 730-738.

    [15] GALOIAN K A, TEMPLE T H, GALOYAN A. Cytostatic effect of novel mTOR inhibitor, PRP-1 (galarmin) in MDA 231 (ER-) breast carcinoma cell line. PRP-1 inhibits mesenchymal tumors[J]. Tumour Biol, 2011, 32(4): 745-751.

    [16] YUNOKAWA M, KOIZUMI F, KITAMURA Y, et al. Efficacy of everolimus, a novel mTOR inhibitor, against basal-like triple-negative breast cancer cells[J]. Cancer Sci, 2012, 103(9): 1665-1671.

    XCL1 mediated by activation of mTOR pathway can promote the proliferation of drug-resistant breast cancer cell

    BAI Yu-pan, YANG Xiao-li, OU Zhou-luo
    (Breast Cancer Institute, Fudan University

    Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

    OU Zhou-luo E-mail: ouzhouluo@163.com

    Background and purpose: More than 90% of cancer patients are incurable because of drug resistance. Activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer, as a target for chemotherapy drugs has become a hot topic of breast cancer treatment. This study aimed to investigate the effect and mechanism of XCL1 on the proliferation of drug-resistant breast cancer cell, whether is related with the mTOR signaling pathway. Methods: Established gemcitabine-resistant breast cancer cell lines (MDA-MB-231/Gem). CCK8 to detect the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-231/Gem, RT-PCR and ELISA to determine the XCL1 expression level of the two cell lines, Western blot to detect the expression of mTOR. Results: Compared with MDA-MB-231, MDA-MB-231/Gem showed an enhanced proliferative capacity. The expression of XCL1 was increased in the resistant cell lines. Both of protein level and phosphorylation level of mTOR increased in drug-resistant cell lines. The MDA-MB-231 added exogenous XCL1 for 24 h, showed an enhanced cell proliferation. Adding anti-XCL1 antibodies in MDA-MB-231/ Gem could reduce cell proliferation and treating MDA-MB-231/Gem with the mTOR inhibitor could also reduce cell proliferation, as well as the XCL1 expression level. Conclusion: XCL1 promotes the proliferation of drug-resistant breast cancer cells mediated by activation of the mTOR pathway.

    MDA-MB-231/Gem; C chemokine ligand 1; mTOR; Breast cancer

    10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.010

    R737.9

    A

    1007-3639(2014)10-0770-07

    2014-03-24

    2014-05-08)

    國家自然科學(xué)基金資助項目(No:81172506);上海市乳腺腫瘤重點(diǎn)實驗室資助項目(No:12DZ2260100)。

    歐周羅 E-mail:ouzhouluo@163.com

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