Hes1在結腸癌組織中的表達及對SW620細胞成瘤能力的影響

楊妙玲 高飛

暨南大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510630

Hes1在結腸癌組織中的表達及對SW620細胞成瘤能力的影響

楊妙玲 高飛*

暨南大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510630

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)Hes1可促進多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移，且Hes1過表達可能會導致結腸癌的發(fā)生。本研究探討Hes1在結腸癌組織中的表達及其對結腸癌SW620細胞株成瘤能力的影響。方法：免疫組化和定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Hes1在結腸癌組織中的表達并分析其表達與結腸癌分化程度的關系；建立Hes1過表達的結腸癌SW620細胞株，qRT-PCR和蛋白質印跡法(Western blot)分別檢測Hes1在mRNA水平和蛋白水平的表達，并在裸鼠體內(nèi)檢測Hes1對SW620細胞皮下成瘤能力的影響。結果：Hes1在正常結腸組織中少許表達，表達多位于結腸腺管的底部。然而Hes1在結腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常結腸組織，且Hes1的表達水平與細胞分化程度呈負相關(P＜0.05)；在結腸癌SW620細胞株中穩(wěn)定轉染Hes1后，Hes1被成功過表達，約380倍(P＜0.05)；用1×105個Hes1過表達的SW620細胞及對照細胞株分別注射至裸鼠皮下，結果Hes1過表達的SW620細胞成瘤能力增強，瘤體較對照組大，生長速度較對照組快。結論：Hes1在結腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常結腸組織，并且隨結腸癌組織分化程度降低而表達量上調；Hes1在體內(nèi)促進結腸癌SW620細胞的成瘤能力。

Hes1；結腸癌；成瘤能力

目前，我國結腸癌發(fā)生率和病死率正在上升，隨著國人飲食結構的改變，結腸癌新發(fā)患者日益增多。早期結腸癌的治療以手術為主，輔以化療和放療，但很多患者在就診時已經(jīng)錯過手術機會，晚期結腸癌的化療效果有限，且容易產(chǎn)生化療耐藥。因此，新的基因治療及生物治療為結腸癌患者的生存獲益帶來希望，尋找有價值的腫瘤標志物對結腸癌的診斷、治療、預后尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，Hes1可促進多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移［1-4］。另有研究表明，Hes1在消化系統(tǒng)的腫瘤形成中起重要作用［5］，另外，Hes1過表達可能會導致結腸癌的發(fā)生［6］。然而，Hes1在結腸癌中的作用及機制尚不明確。

本研究通過檢測Hes1在結腸癌組織中的表達及其對SW620細胞體內(nèi)成瘤能力的影響，進一步探討Hes1與結腸癌的分化程度是否相關，為臨床結腸癌的早期診斷、靶向治療、預后判斷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

臨床標本均為南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科所收集的2010-2012年的77例結腸癌組織和38例非腫瘤組織(由該院鄭林博士提供)。患者術前均未接受放療或化療等抗腫瘤治療。

實驗S P F級裸鼠3～4周齡，體質量16～22 g，雌性(購自廣東省實驗動物中心)。寄養(yǎng)于學校動物中心，在恒溫25～27 ℃、恒濕(45%～50%)、新鮮空氣、除塵除菌的無特殊病原菌飼養(yǎng)室條件下飼養(yǎng)。裸鼠先放于有機玻璃盒內(nèi)，再置于超凈生物層流架內(nèi)，每個飼養(yǎng)盒內(nèi)飼養(yǎng)5～6只，經(jīng)無菌處理的水和飼料供裸鼠自由攝入，高溫消毒的飼料、墊料每3天更換1次，籠具及飲水瓶每3天紫外線消毒1次，飲用無菌蒸餾水。更換飼養(yǎng)用品時嚴格遵循無菌原則操作。

SW620人結腸癌細胞株是在RPMI-1640培養(yǎng)基中用10%胎牛血清(FBS)，在CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)載玻片購自美國Costar公司。Hes1抗體購自美國Bioss公司，1∶500稀釋。10%牛血清白蛋白購自美國Sigma公司。二次山羊抗小鼠或者山羊抗兔抗體購自美國Bioss公司。0.25%胰蛋白酶購自美國Sigma公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Millipore公司。4-，6-二脒基-2-苯基吲哚(propidiumniodide)購自美國Sigma公司。TRIzol試劑、RT試劑盒、擴增預混試劑(擴增產(chǎn)物)購自日本TaKaRa公司。免疫組化試劑化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化分析

石蠟切片脫蠟至水，組織列陣檢測技術TMA部分切片高壓2 min，達到抗原修復，以實現(xiàn)抗原性檢索。培養(yǎng)載玻片在4 ℃溫育過夜，然后將切片顯色劑DAB顯色2 min。每次實驗時，初級抗體被PBS取代作為陰性對照。

染色腫瘤細胞等級評價：無陽性腫瘤細胞為0級，陽性腫瘤細胞＜10%為1級，10%≤陽性腫瘤細胞≤50%為2級，陽性腫瘤細胞＞50%為3級。染色強度評分：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。最后評分的計算方法由染色強度評分乘以染色腫瘤細胞等級。根據(jù)上述方法，染色評分≤4和≥6被分別視為組織的低表達和高表達。

1.3.2 RNA提取、逆轉錄和定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測

采用TRIzol法裂解、氯仿抽提、異丙醇沉淀，從而提取Hes1過表達結腸癌SW620細胞株總RNA。采用逆轉錄試劑盒進行反應后進行聚合酶反應。運用Stratagene公司Mx3005P軟件設計引物，以GAPDH為內(nèi)參照，參照試劑盒說明采用SYBR Green熒光染料法完成。Hes1基因引物序列順義鏈：5’-ACGTGCGAGGGCGTTAATAC-3’；反義鏈：5’-GGGGTAGGTCATGGCATTGA-3’。

1.3.3 蛋白質印跡法(Western blot)檢測

取Hes1過表達的結腸癌SW620細胞株及對照細胞，蛋白質裂解后由10%～15%SDS-PAGE凝膠分離，濕轉法將膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%BSA封閉1.5 h，加Hes1抗體(1∶500)溫育，洗膜后加二抗溫育。ECL顯影液及高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白表達。

1.3.4 裸鼠皮下成瘤實驗

生長狀態(tài)良好的細胞胰酶消化后，PBS液洗滌2次，用PBS重懸細胞，計數(shù)儀計數(shù)，分別將1×105個過表達Hes1的SW620細胞(LV-Hes1)和其對照組(LV-con)隨機接種在裸鼠背部兩側皮膚，待長出腫瘤后每2～3 d測量瘤徑(長徑和短徑)，計算瘤體積：體積=(長徑×短徑×短徑)/2。待瘤體積超過500 mm3時，處死裸鼠，取出組織。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。結果采用兩獨立樣本t檢驗，數(shù)值大小以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Hes1在結腸癌組織中的表達

本研究通過免疫組化法和qRT-PCR法，發(fā)現(xiàn)Hes1在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常結腸組織(圖1A)，且Hes1在結腸癌組織中的mRNA表達明顯高于癌旁正常結腸組織(圖1B)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 Hes1與結腸癌分化程度的關系

Hes1在正常結腸組織中少許表達，表達主要位于結腸腺管的底部(圖2A)。然而Hes1在結腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常結腸組織，且在低分化結腸癌組織中的表達(圖2C)高于高分化結腸癌組織(圖2B)。

2.3 建立Hes1穩(wěn)定過表達的結腸癌SW620細胞株

把LV-Hes1用瑞士包裝系統(tǒng)包裝病毒后感染結腸癌SW620細胞。在mRNA水平和蛋白水平檢測實驗組(LV-Hes1)與對照組(LV-con)中Hes1的表達，結果顯示，在Hes1過表達后，LVHes1組在mRNA水平的表達較LV-con組顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖3A)。進一步通過Western blot檢測Hes1在蛋白水平的表達，證實Hes1的過表達(圖3B)。

圖1 Hes1在結腸癌組織中的表達Fig. 1 Increased expression of Hes1 in human colon cancer tissues

2.4 Hes1增強結腸癌SW620細胞的皮下成瘤能力

皮下成瘤實驗結果顯示，兩組裸鼠的腫瘤形態(tài)均為圓形或橢圓形，邊界較清楚，有纖維包膜包裹，符合裸鼠皮下成瘤特點。但LVHes1組腫瘤體積較LV-con組大(圖4A)，且LVHes1組腫瘤生長較快(圖4B，P＜0.01)。

圖2 Hes1在不同分化程度結腸癌中的表達Fig. 2 Hes1 expression in human colon cancer tissues

圖3 過表達Hes1后SW620細胞株中Hes1的表達Fig. 3 Expression of Hes1 in Hes1 overexpressing SW620 cell lines

圖4 過表達Hes1后SW620細胞的體內(nèi)成瘤能力Fig. 4 Effect of Hes1 on the ability of tumour-formation in Hes1 overexpressing SW620 cells

3 討 論

結腸癌起病隱匿，患病初期癥狀不明顯，且進展迅速，大多數(shù)患者就診時已是中晚期，因此尋找理想的腫瘤標志物用于診斷、治療、預后評估將有較高的臨床價值。在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，常涉及到多種蛋白質表達的改變，然而哪些可作為結腸癌發(fā)生、發(fā)展及預后的腫瘤標志物成為當今研究之難點。

迄今，脊椎動物的6種Hes分子(Hes1～6)已被發(fā)現(xiàn)，其中Hes1分子表達最為廣泛，人類的Hes1含268個氨基酸殘基，相對分子質量約為35×103。Hes1是前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋(proneural basic helix-loop-helix，bHLH)轉錄因子家族中的成員，有研究已經(jīng)證實，Hes1基因可通過PTEN/PI3K/Akt/ mTOR信號通路抑制抑癌基因p53表達阻止細胞凋亡［7-8］。Hes1作為Notch蛋白的下游靶基因，將Notch信號下傳，可使多種不成熟細胞維持在未分化狀態(tài)，以確保正確的分化方向。有研究表明，Hes1在急性淋巴細胞白血?。?］、肺癌［9］、宮頸癌［10-11］、卵巢癌［12］、骨肉瘤［13］、星形細胞瘤［14］和胃癌［15］中起到癌基因的作用，能促進腫瘤增殖、轉移和浸潤侵襲。金黑鷹等［16］及Michael等［17］研究提示，Notch1、Hes1在結腸癌中的表達一致，而且Notch1的表達程度與細胞的分化程度呈負相關。然而，Hes1在結腸癌中的確切作用尚缺乏系統(tǒng)研究。

本研究首先檢測了Hes1在結腸癌組織及癌旁正常結腸組織中的表達，結果Hes1在癌旁正常結腸組織和結腸癌組織中都有表達，但在癌組織中的表達顯著較癌旁正常組織高，且Hes1的表達水平與細胞的分化程度呈負相關，即分化程度越低，Hes1的表達水平越高。結果表明，Hes1的定性和定量，可能對結腸組織的癌變與否及分化程度的診斷有輔助價值。

接著我們建立了穩(wěn)定過表達Hes1的SW620細胞株，并進行了皮下成瘤實驗。結果表明Hes1的表達與腫瘤的體積、生長速度、腫瘤出現(xiàn)時間有關。LV-Hes1的最終瘤體積較LV-con的瘤體積大，且生長明顯迅速，表明Hes1增強結腸癌SW620細胞株的成瘤能力。因此我們推測，Hes1過表達，可促進腫瘤發(fā)生和生長。并且我們發(fā)現(xiàn)過表達Hes1的瘤體形態(tài)大，充血明顯，推測可促使腫瘤細胞進入血液循環(huán)，增加腫瘤復發(fā)及轉移的機會，此部分將會實施進一步的實驗驗證。另外，Hes1促進腫瘤細胞的體內(nèi)成瘤能力，且有報道表明其與干細胞的維持相關，我們推測Hes1與腫瘤干細胞的干性維持亦相關，仍需進一步證實。

綜上所述，目前國內(nèi)外關于Hes1在結腸癌中的表達、作用及機制尚很少見，我們的結果表明Hes1的過表達可能導致結腸癌的發(fā)生和發(fā)展，然而，其具體作用機制仍需進一步探討。

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Increased expression of Hes1 and its effect on tumour-formation ability in colon cancer

YANG Miao-ling, GAO Fei*
(Department of Gastroenterology, the First Af fi liated Hospital of Jinan University, Guangzhou Guangdong 510630, China)

GAO Fei E-mail: gaofeidoc@163. com

Background and purpose: It is reported that Hes1 is related to the progression and metastasis of many kinds of tumor. This study was to investigate the expression of Hes1 in colon cancer and its effect on tumourformation ability of SW620 cells. Methods: The expression of Hes1 in colon cancer tissues and control normal samples was analyzed by immunohistochemistry and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRTPCR), and the relationship between Hes1 expression and differentiation in human colon cancer was detected. Hes1 overexpressing SW620 cell lines were established, and the expression of Hes1 mRNA and protein was detected by qRTPCR and Western blot simultaneously. We also detected the effect of Hes1 on the ability of tumour-formation in Hes1 overexpressing SW620 cells in nude mice in vivo. Results: We found that Hes1 was expressed in almost all normal tissues, particularly at the bottom of the crypts, and in all cancer tissues, including moderate and poorly differentiated cancer samples and well-differentiated cancer samples. In addition, the expression of Hes1 in poorly differentiated cancer samples was higher than that observed in well-differentiated tumor (P＜0.05). After stably transfected Hes1 in SW620 colon cancer cell lines, Hes1 was overexpressed successfully (P＜0.05). We injected 1×105Hes1-overexpressing colon cancer cells and the control cells into nude mice subcutaneously, and found Hes1-overexpressing tumours exhibited signi fi cantly bigger size compared with that observed in controls. The growth of the Hes1-overexpressingtumours was found to be slightly faster than those of the controls. Conclusion: Hes1 is overexpressed in colon cancer than that in normal tissue, and Hes1 is upregulated in poorly differentiated cancer samples compared with welldifferentiated tumour samples. Hes1 has a positive in fl uence on the ability of tumour-formation in SW620 cells in vivo.

Hes1; Colon cancer; Tumor-formation ability

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.09.002

R735.3+5

A

1007-3639(2014)09-0646-06

2014-04-24

2014-06-20）

＊：原工作單位為南方醫(yī)科大學。

國家自然科學基金青年項目(No：81401973)；廣東省醫(yī)學科研基金(No：B2014222)；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(No：21614304)。

高飛 E-mail:gaofeidoc@163.com