蛋雞感染H9N2AIV后輸卵管不同部位病毒的分布及病理組織學(xué)觀察

陳占莉，曹曉蕾，唐 超，江躍德，黃晶晶，李 濤，王秋珍，伍成奇，王晶鈺

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

蛋雞感染H9N2AIV后輸卵管不同部位病毒的分布及病理組織學(xué)觀察

陳占莉，曹曉蕾，唐 超，江躍德，黃晶晶，李 濤，王秋珍，伍成奇，王晶鈺＊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

為探索H9N2AIV感染蛋雞致輸卵管功能異常的機(jī)理，對蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管不同部位病毒載量與病理變化進(jìn)行檢測與觀察。以H9N2亞型AIV人工感染非免疫蛋雞，在感染后3、5、7 d分別采取雞輸卵管組織，real-time PCR檢測感染雞輸卵管組織中AIV病毒載量，同時(shí)HE染色后觀察病理組織學(xué)變化。結(jié)果表明，real-time PCR從雞輸卵管膨大部、峽部、子宮部和陰道部均檢出了禽流感病毒，其中以膨大部和子宮部病毒載量最高，分別達(dá)5.27×104拷貝／μL±3.55×103拷貝／μL和5.52×104拷貝／μL±3.14×103拷貝／μL。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管膨大部、峽部和子宮部病變明顯。觀察到上皮細(xì)胞脫落壞死，炎性細(xì)胞浸潤腺體，腺體間隙變大甚至溶解，腺體組織充血出血。本研究證實(shí)蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管組織中AIV病毒載量與其病理變化存在明顯的正相關(guān)。

雞輸卵管；H9N2亞型禽流感病毒；病理變化；病毒載量

雞輸卵管是雞蛋形成的重要器官，依據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能分為漏斗部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部5個(gè)部分。其中膨大部的分泌物形成雞蛋的蛋白和系帶，峽部的分泌物形成雞蛋的內(nèi)外殼膜，而子宮部是蛋殼形成的場所［1］。雞輸卵管發(fā)生炎癥、水腫、出血等病變，其功能異常將會(huì)對雞蛋的形成產(chǎn)生影響［2］。禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）感染蛋雞群除發(fā)生死亡、引起宿主免疫抑制外，還可造成蛋雞群產(chǎn)蛋量下降30%～80%，產(chǎn)退色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋，受精率及孵化率下降，病程持續(xù)時(shí)間長的可達(dá)月余［3］。發(fā)病雞剖檢可見生殖系統(tǒng)出現(xiàn)卵泡變形充血，甚至破裂，腹腔內(nèi)有破裂的卵黃出現(xiàn)卵黃性腹膜炎；輸卵管出血，內(nèi)有白色黏稠的分泌物，甚至粘連，有成型蛋滯留產(chǎn)道［4］。多年來，國內(nèi)外研究主要集中在AIV對家禽呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的致病方面［5］，有關(guān)蛋雞感染AIV致雞輸卵管功能異常的機(jī)理研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)用低致病性H9N2亞型AIV人工感染非免疫蛋雞，感染后不同時(shí)間采取雞輸卵管組織，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測感染雞輸卵管組織不同部位中AIV病毒載量，通過HE染色觀察其病理組織學(xué)變化。探討蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管組織中病毒載量與病理變化的關(guān)系，以期為蛋雞感染H9N2亞型AIV后發(fā)生產(chǎn)蛋異常機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與試驗(yàn)用動(dòng)物 H9N2亞型AIV（A／chicken／Shaanxi／11／2012）毒株，從一只病死雞中分離得到，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室鑒定保存［6］。25周齡非免產(chǎn)蛋高峰期羅曼蛋雞（H9N2禽流感病毒HI抗體≤2Log2）、10日齡SPF雞胚由楊凌綠方生物工程有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 蘇木素、伊紅染液購自碧云天生物技術(shù)研究所；SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR、pMDTM19-T vector Cloning試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽疫病防治和畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 H9N2亞型AIV人工感染非免疫蛋雞及臨床癥狀觀察 將保存于－80℃的H9N2亞型AIV保存液復(fù)蘇做1 000倍稀釋，0.1mL接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，37℃溫箱孵育，接種72h后無菌收集尿囊液。血凝試驗(yàn)測定其血凝價(jià)為27～8，置－80℃保存?zhèn)溆?。用前測定EID50。模仿自然感染通過滴鼻、點(diǎn)眼（106.83EID50／mL／只）攻毒25周齡眼觀健康、經(jīng)禽流感病毒抽檢呈陰性的非免蛋雞9只，同時(shí)設(shè)3只為對照組。對照組與感染組嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，蛋雞自由采食及飲水。雞舍嚴(yán)格消毒，并將排泄物進(jìn)行無害化處理。每天觀察感染蛋雞臨床癥狀，并于感染后第3、5、7天分別頸部放血處死3只蛋雞，對照組蛋雞于第7天處死，分離并采取輸卵管。將采集的雞輸卵管組織按5個(gè)部位分別分成兩組，第1組立即保存于液氮中備用，第2組40g／L多聚甲醛溶液固定24h后制作石蠟切片。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成 參考GenBank中H9N2亞型AIV的 M基因的核酸序列（KC767262）［6］，利用Oligo 6.0軟件，設(shè)計(jì)引物，所設(shè)計(jì)的特異性上、下游引物序列分別為：5′-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′；5′-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3′。預(yù) 計(jì) 擴(kuò) 增 片段長度為229bp，由上海英駿生物工程有限公司合成。

1.2.3 陽性重組質(zhì)粒的制備 按照Trizol法提取H9N2亞型AIV RNA，立即將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增M基因片段。20g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，純化回收PCR陽性產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物與pMDTM19-T vector連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性的菌液按高純質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒并PCR擴(kuò)增，EcoRⅠ 和SalⅠ雙酶切鑒定質(zhì)粒。將PCR和雙酶切鑒定均為陽性的菌液送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒命名為pMD-M，作為構(gòu)建H9N2亞型AIV M基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD-M連續(xù)10倍梯度稀釋，選101～106稀釋度作為real-time PCR模板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為20μL：陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD-M 2μL，SYBR Green Reaction Mix 10 μL，dd H2O 10μL，上、下游引物各0.5μL。最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；94℃15s，55℃20s，72℃50s，共40個(gè)循環(huán)。每次試驗(yàn)均設(shè)立1個(gè)空白對照，當(dāng)空白對照為陰性時(shí)，試驗(yàn)有效［7］。

1.2.5 Real-time PCR 檢測 H9N2亞型 AIV 感染蛋雞輸卵管不同部位組織中禽流感病毒載量 將保存于液氮中的輸卵管組織按Trizol法提取RNA。立即將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并測定cDNA濃度。將各部位稀釋成相同的濃度，作為real-time PCR檢測的模板。反應(yīng)體系與條件同1.2.4。

1.2.6 蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管不同部位病理組織學(xué)觀察 將固定好的雞輸卵管組織常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色觀察其病變［2］。

1.2.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù) 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007處理數(shù)據(jù)，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的 One-way ANOVA過程進(jìn)行單因子方差分析，以P＜0.01為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 H9N2亞型AIV M基因RT-PCR擴(kuò)增

以H9N2亞型AIV cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得229bp條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 M基因的克隆

將擴(kuò)增的M基因PCR產(chǎn)物回收后與pMDTM19-T vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌落提取質(zhì)粒；陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ 和SalⅠ雙酶切鑒定，得到2 692bp和229bp的兩個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。本試驗(yàn)成功克隆了5株AIV的M基因（圖2）。重組質(zhì)粒pMD-M測序結(jié)果顯示序列正確，無突變。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋重組質(zhì)粒pMD-M為模板進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，根據(jù)DNA拷貝數(shù)和Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。Real-time PCR對 H9N2亞型AIV M基因的擴(kuò)增效率（E）為93%；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9901，該值接近1；產(chǎn)物Ct值與濃度之間的線性關(guān)系好，并且在102～107拷貝／反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。結(jié)果說明本試驗(yàn)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地對待檢測產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

2.4 H9N2亞型AIV感染雞輸卵管組織中AIV載量的測定

參照標(biāo)準(zhǔn)曲線由Ct值計(jì)算得病毒載量，N／A代表未檢測到病毒。從表1可以得出雞輸卵管5個(gè)部位除漏斗部未檢測到禽流感病毒外，其他4個(gè)部位都檢測出了禽流感病毒。而且病毒載量有一定的差異性，其中膨大部和子宮部差異不顯著（P＞0.05），峽部和陰道部差異不顯著（P＞0.05），而漏斗部和膨大部、峽部、子宮部、陰道部差異極顯著（P＜0.01）。

2.5 蛋雞感染H9N2亞型AIV臨床癥狀及病變

蛋雞于攻毒后第3天出現(xiàn)精神沉郁、臉部水腫、采食量下降等臨床癥狀；部分蛋雞產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)軟殼蛋；剖檢未見明顯病理變化。攻毒后第5天，試驗(yàn)組蛋雞只有1只雞產(chǎn)軟殼蛋，其余均停止產(chǎn)蛋；且蛋雞精神極度沉郁、采食量極少、臥地不起；剖檢發(fā)現(xiàn)輸卵管發(fā)炎、水腫。攻毒后第7天，蛋雞均停止產(chǎn)蛋；剖檢發(fā)現(xiàn)輸卵管出血，內(nèi)有大量黏液性物質(zhì)，有一條輸卵管中有成型蛋滯留。

2.6 H9N2亞型AIV感染蛋雞輸卵管不同部位病理組織學(xué)觀察

圖1 H9N2亞型AIV M基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR products of M gene of H9N2subtype

蛋雞感染H9N2亞型AIV后，輸卵管組織主要受損傷的部位為膨大部、峽部和子宮部，病理學(xué)觀察可見上皮細(xì)胞脫落壞死，腺體間隙變大、有炎性細(xì)胞侵入腺體、腺體組織充血出血。漏斗部和陰道的病變不明顯。

圖2 M基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of M gene recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion

圖3 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of real-time PCR

表1 感染雞輸卵管組織中禽流感病毒載量的real-time PCR測定Table 1 The viral load detection results of real-time PCR in tissue of 9hen oviducts

2.6.1 漏斗部病理變化 可見輕度的上皮細(xì)胞脫落及炎性細(xì)胞侵潤（圖4）。A1為對照組蛋雞輸卵管漏斗部。A2、A3、A4分別為攻毒后第3、5、7天試驗(yàn)組蛋雞輸卵管漏斗部的病理組織變化。A1顯示漏斗部的漿膜被覆單層纖毛柱狀上皮，由纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成，其固有層內(nèi)有管狀腺。A2中未顯示明顯的病理變化。A3中b顯示腺體中有少量的腺上皮細(xì)胞脫落。A4中a顯示有柱狀上皮細(xì)胞脫落壞死，c顯示管狀腺中有炎性細(xì)胞侵潤。

2.6.2 膨大部病理學(xué)變化 可見有大量的上皮細(xì)胞脫落壞死、炎性細(xì)胞侵入腺體、腺上皮細(xì)胞脫落及腺體溶解（圖5）。B1為對照組蛋雞輸卵管膨大部。B2、B3、B4分別為攻毒后第3、5、7天試驗(yàn)組蛋雞輸卵管膨大部的病理組織變化。B1顯示膨大部具有密生腺管漿膜被覆單層纖毛狀或假復(fù)層纖毛柱狀上皮，由柱狀上皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成。B2中a顯示有大量的柱狀上皮細(xì)胞脫落甚至壞死。B3中a顯示有大量的柱狀上皮細(xì)胞脫落壞死以致漿膜層斷裂；b顯示腺上皮細(xì)胞脫落。B4中a顯示絨毛減少，漿膜層斷裂；b顯示腺上皮細(xì)胞脫落壞死，腺體間隙變大；c顯示管狀腺中有大量的炎性細(xì)胞侵潤以致腺體輪廓不清。

2.6.3 峽部病理學(xué)變化 顯微觀察可見漿膜上皮斷裂，腺體溶解（圖6）。C1為對照組蛋雞輸卵管峽部。C2、C3、C4分別為攻毒后第3、5、7天試驗(yàn)組蛋雞輸卵管峽部的病理組織變化。C1顯示峽部縱行漿膜褶含有很多次級褶，肌層發(fā)達(dá)。C2種b顯示腺上皮細(xì)胞脫落壞死。C3中d顯示有大量的腺體溶解，部分腺體消失。C4中a顯示絨毛減少，漿膜層斷裂；d顯示腺體溶解致其輪廓不清。

圖4 漏斗部病理組織學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.4 Histopathological lesions of infundibulum （HE staining，400×）

圖5 膨大部病理組織學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.5 Histopathological lesions of magnum （HE staining，400×）

圖6 峽部病理組織學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.6 Histopathological lesions of isthmus（HE staining，400×）

2.6.4 子宮部病理學(xué)變化 主要病變?yōu)闈{膜上皮斷裂，腺體溶解，組織充血出血（圖7）。D1為對照組蛋雞輸卵管子宮部。D2、D3、D4分別為攻毒后第3、5、7天試驗(yàn)組蛋雞輸卵管子宮部的病理組織變化。D1顯示為漿膜被覆假復(fù)層纖毛柱狀上皮，由纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成。固有層內(nèi)有短而細(xì)的分支管狀腺。D2種a顯示絨毛減少；d顯示腺體溶解、輪廓不清。C3中e顯示腺體中組織充血與出血。D4中a顯示絨毛減少，漿膜層斷裂；d顯示腺體輪廓不清。2.6.5 陰道部病理學(xué)變化 觀察可見輕度的上皮細(xì)胞脫落（圖8）。E1為對照組蛋雞輸卵管陰道部。E2、E3、E4分別為攻毒后第3、5、7天試驗(yàn)組蛋雞輸卵管陰道部的病理組織變化。E1顯示固有層內(nèi)有少量單管狀腺，其肌層發(fā)達(dá)。E2中未顯示明顯的病理變化。E3和E4顯示有上皮細(xì)胞脫落壞死。

圖7 子宮部病理組織學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.7 Histopathological lesions of uterus（HE staining，400×）

圖8 陰道部病理組織學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.8 Histopathological lesions of vagina（HE staining，400×）

3 討論

H9N2亞型AIV感染蛋雞可致其產(chǎn)蛋量下降，病愈后難以恢復(fù)原有水平；產(chǎn)畸形蛋、軟殼蛋、沙殼蛋；病雞輸卵管發(fā)炎、出血、水腫，管內(nèi)有白色膠凍樣或干酪樣物質(zhì)［8－9］。本試驗(yàn)人工感染蛋雞H9N2亞型AIV，感染3d后蛋雞產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)軟殼蛋，5d后停止產(chǎn)蛋。蛋雞剖檢發(fā)現(xiàn)輸卵管壁發(fā)炎，管腔中黏膜脫落、內(nèi)有大量膿性分泌物，其中有2只蛋雞輸卵管萎縮，1只蛋雞輸卵管有成型蛋滯留。該試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

Real-time PCR檢測方法已廣泛應(yīng)用于mRNA的表達(dá)研究、測定單核苷酸（SNPs）的多態(tài)性及檢測DNA 的拷貝數(shù)等［10］。目前，real-time PCR 方法已被成功地應(yīng)用于AIV的流行病學(xué)調(diào)查、診斷及檢測研究［11－14］。Zhu Z等［7］采用 SYBR Green-based real time RT-PCR檢測方法對2013年發(fā)生的H7N9 AIV進(jìn)行了檢測，為H7N9AIV的快速診斷奠定了基礎(chǔ)。萬春和等［15］通過SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對蛋鴨中H9N2亞型AIV進(jìn)行了特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好的檢測。本研究通過設(shè)計(jì)AIV M基因引物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對H9N2亞型AIV感染蛋雞輸卵管組織中AIV病毒載量進(jìn)行了定量分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示蛋雞輸卵管5個(gè)部位除漏斗部未檢測到禽流感病毒外，其他4個(gè)部位都檢測到禽流感病毒，且病毒載量有一定的差異性。其中膨大部和子宮部病毒載量最高且差異不顯著（P＞0.01），峽部和陰道部病毒載量次之且差異不顯著（P＞0.01），而漏斗部和膨大部、峽部、子宮部、陰道部差異極顯著（P＜0.01）。

Sae Silva M等［2］證實(shí)高致病性禽流感病毒能夠致蛋雞生殖道組織損傷并發(fā)生明顯病理變化。本試驗(yàn)通過HE染色發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV感染蛋雞，輸卵管主要受損傷的部位是膨大部、峽部和子宮部，而傘部和陰道部只見有少量上皮細(xì)胞脫落。膨大部有大量柱狀上皮細(xì)胞脫落甚至壞死以致漿膜層斷裂，腺上皮細(xì)胞脫落、腺體間隙變大，腺體中有大量的炎性細(xì)胞侵潤以致腺體輪廓不清。膨大部是蛋白形成的場所［16］，故其受到損害輸卵管分泌物異常即出現(xiàn)炎癥。峽部有部分腺體溶解消失。子宮部腺體溶解、輪廓不請，腺體組織充血、出血。峽部的分泌物形成雞蛋的內(nèi)外殼膜［1］，子宮部主要參與蛋殼的形成［17］。H9N2亞型AIV感染對子宮部及峽部的損傷會(huì)導(dǎo)致蛋殼及殼膜不能正常形成，這可能是蛋雞感染流感病毒后產(chǎn)軟殼蛋和沙皮蛋等劣質(zhì)蛋的原因之一。漏斗部和陰道部在雞蛋的生成過程中分別提供受精場所及產(chǎn)出的通道，并不參與雞蛋的形成?？梢?，AIV感染蛋雞對輸卵管的損傷主要在對雞蛋生成過程起重要作用的部位。

本試驗(yàn)對蛋雞感染流感病毒后輸卵管不同部位病理變化與病毒載量相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)合real-time PCR檢測結(jié)果與HE染色，發(fā)現(xiàn)病毒載量檢出多的部位發(fā)生明顯的組織病理學(xué)變化，即蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管不同部位組織病理變化與流感病毒載量存在明顯的正相關(guān)。蛋雞感染H9N2亞型AIV后輸卵管組織中病毒的侵入導(dǎo)致組織損傷是蛋雞在臨床上出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)劣質(zhì)蛋的重要原因。

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Distribution and Pathological Observation Avain Influenza Virus H9N2in Hen Oviducts

CHEN Zhan-li，CAO Xiao-lei，TANG Chao，JIANG Yue-de，HUANG Jing－jing，LI-Tao，WANG Qiu-zhen，WU Cheng－qi，WANG Jing－yu

（CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yanglin，Shaanxi，712100，China）

In order to explore the mechanism about the abnormal function of hens oviduct，the viral loads were detected and histologic changes were observed in hens oviduct infected with H9N2AIV.Hens were infected with H9N2AIV experimentally.Tissue samples of the hen oviducts were collected at 3，5，and 7 days post-inoculation.real-time PCR was used to detect the AIV viral loads and HE staining was employed to observe the histopathological lesions in the hen oviducts.The results showed that the AIV viral loads in hen oviducts were detected.The viral loads in magnum and uterus were higher，5.27×104±3.55×103copies／μL and 5.52×104±3.14×103copies／μL respectively.Obvious pathological lesions were presented in magnum，isthmus and uterus.Epithelial villus fell off，broad hemorrhage，inflammatory cell invasion and gland necrosis were observed in hen oviducts.This study showed that the viral loads were positively correlated with the histopathological lesions in hen oviducts.

H9N2avian influenza virus；hen oviduct；pathological lesion；viral load

S852.659.5

A

1007-5038（2014）11-0056-06

2014-05-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272577）

陳占莉（1985－），陜西榆林人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。＊通訊作者