神經(jīng)生長因子控釋凝膠促進大鼠周圍神經(jīng)損傷后再生的研究

王利兵 敖強

【摘要】目的：運用纖維蛋白膠(FG)結(jié)合神經(jīng)生長因子（NGF）包裹SD大鼠坐骨神經(jīng)斷端，通過纖維蛋白膠控釋NGF以促進神經(jīng)纖維再生并減少神經(jīng)吻合口瘢痕形成。方法: SD大鼠24只，隨機分為2組 ，每組12只。 A組：大鼠坐骨神經(jīng)切斷后神經(jīng)外膜直接縫合，然后吻合口包裹 FG/NGF凝膠，B組：神經(jīng)外膜直接縫合，吻合口未包裹凝膠。分別于術(shù)后第1、3、5、7周行術(shù)側(cè)足跡實驗檢測，術(shù)后2月行術(shù)側(cè)三頭肌濕重恢復(fù)率測量、電生理測定、甲苯胺藍染色、透射電鏡分析等。結(jié)果:同一時間段兩組間比較，各指標(biāo)A組明顯好于B組。結(jié)論：NGF緩釋凝膠可以促進大鼠坐骨神經(jīng)離斷損傷的修復(fù)并防止吻合口與周圍組織粘連。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)生長因子；纖維蛋白凝膠；周圍神經(jīng)；損傷；再生；

【Abstract】Objective：To evaluate the effect of the controlled release of biodegradable FG ,nerve growth factor (FG/ NGF) on peripheral nerve defect. Methods ：towenty-four Sprague2 Dawly rats were randomly divided into two groups, FG/ NGF(group A , n = 12),Stitching of combine (group B ,n = 12).Each rat underwent right sciatic nerve cuting into two pieces，then these defects were repaired in the two different experimental groups.The process of the peripheral nerve regeneration was evaluated at 2 months following operation,and the evaluated items were footprinting test, triceps weight ,electrophysiological ,Immunohistochemistr ,Methylene, Blue trihydrate axon morphologic assessment of the outcome of nerve regeneration. Results：Nerve regeneration in group A was comparable with that seen in natuai Nerve and was significantly superior to that in B groups in all indexes. Conclusion：: FG/ NGF controlled release was a potential ideal， that can effectively promote nerve regeneration after sciatic nerve defect of rats. The effect was as good as that of natual Nerve.

【key words 】 NGF; FG； Peripheral nerve； Nerve defect； Rgeneration

【中圖分類號】R722.12 【文獻標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)06-0200-01

材料與方法

1．主要試劑及設(shè)備：重組大鼠NGF及bFGF,NF200及S100兔抗鼠抗體，纖維蛋白凝膠，電生理儀及信息采集系統(tǒng)等。健康幼年雄性 SD 鼠 24 只，體重 250～300 g ,隨機分為 A（實驗組）、 B (對照組）兩組 ,每組12 只；該課題研究所用動物（SD鼠）、全部的手術(shù)流程，以及SD鼠的全部喂養(yǎng)流程全部符合1996年版《北京市實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。

2．動物實驗?zāi)Ｐ椭谱鳎核写笫蟮氖中g(shù)部位為右大腿 ,左大腿設(shè)為正常對照。術(shù)區(qū)常規(guī)備皮，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于大鼠右股后外側(cè)行縱形切口,顯露坐骨神經(jīng)約2. 5 cm。A 組于右側(cè)坐骨神經(jīng)上中段橫行切斷后以11-0無創(chuàng)顯微縫合線外膜縫合法連續(xù)縫合4針，將配置好的FG/ NGF取適量涂抹于吻合神經(jīng)斷端，最后將肌肉和皮膚逐層縫合，并在切口處涂抹少許青霉素粉末。B組手術(shù)方法同A組，但神經(jīng)吻合斷端只行外膜縫合，未予FG/ NGF涂抹。術(shù)后8周行足跡試驗、神經(jīng)電生理測定、三頭肌濕重比、組織學(xué)檢測等。

3．坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）：是公認(rèn)的用來評定術(shù)后坐骨神經(jīng)運動功能恢復(fù)情況的一項重要指標(biāo)。術(shù)后8周測定各組SFI值。SFI為0提示坐骨神經(jīng)功能正常，SFI為-100提示坐骨神經(jīng)功能基本完全喪失。

4．神經(jīng)電生理測定：我們于術(shù)后 2月行動物實驗，將局部坐骨神經(jīng)充分游離 ,避免損傷坐骨神經(jīng)外膜，將刺激電極插入吻合口近端的神經(jīng)干上 ,在小腿三頭肌處插入記錄電極(丹麥產(chǎn)高性能誘發(fā)電位/ 肌電圖檢測儀 4000 型)用于測量該段坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度，及潛伏期的長短；

5．三頭肌濕重比測量：術(shù)后8周完整切取大鼠雙側(cè)三頭肌,沾去附著的血液 ,用天平稱量濕重 ,進行雙側(cè)對比，以觀察肌肉恢復(fù)率(實驗側(cè)/ 正常側(cè)) ；

6． 組織學(xué)檢查：神經(jīng)電生理測量完畢后，分別切取右側(cè)坐骨神經(jīng)吻合口部位遠、 中、 近各段少許，做軸向切取 ,固定后48 h 備用. 最后將各段神經(jīng)組織分別進行免疫組織化學(xué)測定、超薄切片透射電鏡觀察等組織形態(tài)學(xué)的觀察和分析。

7．統(tǒng)計學(xué)分析：統(tǒng)計結(jié)果以（X±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，分析軟件為spss軟件，P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1．SFI值：圖1中描述了坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)術(shù)后3周、5周、8周大鼠患肢的SFI值。下面的坐標(biāo)直方圖很好的反應(yīng)了術(shù)后不同階段兩組足跡實驗所測值的變化。

（圖1）足跡試驗測定

圖1：術(shù)后3、5、8周實驗組（纖維蛋白凝膠神經(jīng)生長因子）與對照組（直接縫合）的SFI值及其組間對比圖；

2．神經(jīng)電生理測定：動物手術(shù)，以坐骨神經(jīng)吻合口為中心，游離坐骨神經(jīng)，保護坐骨神經(jīng)，防止損傷，保護神經(jīng)外膜，選擇長度為0.03m的坐骨神經(jīng)段，計算各實驗組（正常組、實驗組、對照組）在該段坐骨神經(jīng)的平均傳導(dǎo)速度。如下表（1）

附表（1）

組別 術(shù)側(cè) 健側(cè)實驗組

對照組 58±7.3

47±5.2 83±0.5

84±2.1注：各實驗組于術(shù)后2月在該段坐骨神經(jīng)的平均傳導(dǎo)速度（X±sD，m∕s）

統(tǒng)計結(jié)果表明，對照組再生坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于實驗組再生坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，有顯著性差異（P〈0.05）。而實驗組與對照組再生神經(jīng)的傳導(dǎo)速度均明顯低于健側(cè)正常神經(jīng)（P〈0.05）。

3．肌肉濕重比：圖（2）描述了A組（實驗組）和B組（對照組）神經(jīng)修復(fù)術(shù)后2月各組手術(shù)側(cè)和正常側(cè)三頭肌的濕重比值。圖中顯示術(shù)后手術(shù)側(cè)的肌肉均發(fā)生一定程度的萎縮，但A組（實驗組）肌肉濕重比（0.61）明顯高于B組（0.43）。

（ 圖2）肌肉濕重比圖

4．坐骨神經(jīng)超薄切片透射電鏡觀察：（圖3）為A組和B組SD鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)后8周，手術(shù)側(cè)損傷中段的再生坐骨神經(jīng)纖維、正常大鼠坐骨神經(jīng)纖維橫切面的超薄切片透射電鏡圖像。其中實驗組軸突直徑和髓鞘厚度與正常坐骨神經(jīng)比較接近，但低于正常神經(jīng)。而對照組的軸突直徑最小，髓鞘厚度最薄，且神經(jīng)纖維橫截面不夠規(guī)則。

正常神經(jīng)纖維實驗組中段神經(jīng)纖維對照組中段神經(jīng)纖維

（圖3）

附表2為image-pro- plus軟件分析的正常神經(jīng)組織、A組（FG∕NGF）及（直接縫合）再生神經(jīng)中段的有髓神經(jīng)纖維的平均密度，軸突的直徑，髓鞘的厚度等結(jié)果。

附表2

神經(jīng)纖維密度（n∕mm2）髓鞘厚度（nm） 軸突直徑（nm）實驗組(A)：1125±686. 96±0. 71. 56±0. 154對照組(B)：904±47 5. 27±0. 62 1. 32±0. 046該表詳細(xì)統(tǒng)計了實驗組和對照組術(shù)后2月坐骨神經(jīng)斷端遠端再生神經(jīng)纖維密度、髓鞘厚度、軸突直徑等各項相關(guān)指標(biāo)的準(zhǔn)確參數(shù)， 實驗組和對照組2組坐骨神經(jīng)遠端都有神經(jīng)纖維生長。但A組（FG∕NGF）再生神經(jīng)干的神經(jīng)纖維密度、髓鞘厚度、軸突直徑等指標(biāo)均優(yōu)于對照組( P< 0. 05）。說明該方案（FG∕NGF） 對大鼠坐骨神經(jīng)再生功效有明顯的促進作用。

討 論

應(yīng)用外源性神經(jīng)生長因子可以促進神經(jīng)生長。但是目前多以全身用藥方式為主，且用量大、副作用多。損傷局部應(yīng)用缺乏理想的載體，因子釋放時間短，不能維持長時間持續(xù)作用，因此尋找一種安全有效的神經(jīng)生長因子控制釋放的載體迫切而必要。而纖維蛋白是天然的血液成分，具有組織反應(yīng)小、生物作用多等優(yōu)點，其生物制品廣泛應(yīng)用于臨床，具有成為神經(jīng)生長因子載體的潛力。

實驗從神經(jīng)電生理測定、肌肉濕重比測定、組織學(xué)檢測所得數(shù)據(jù)都明確的體現(xiàn)了實驗組坐骨神經(jīng)斷端神經(jīng)纖維的再生情況明顯優(yōu)于對照組。通過神經(jīng)粘合口纖維蛋白膠緩慢釋放神經(jīng)生長因子(NGF)有效地促進神經(jīng)纖維再生和成熟 ,且減少局部纖維瘢痕形成。

參考文獻

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