高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用

杜曉春

【摘要】 本文簡要介紹高效液相色譜技術(shù)的歷史發(fā)展，對幾種常見的高效液相色譜進(jìn)行了介紹，評述了高效液相色譜法（HPLC）在藥物分析的應(yīng)用。由于HPLC具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，因此在藥物成分的分離與測定方面充分發(fā)揮了其優(yōu)勢。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜；藥物分析中；應(yīng)用

文章編號：1004-7484（2014）-06-3049-02

1 高效液相色譜（HPLC）概論

1.1 高效液相色譜的歷史發(fā)展 高效液相色譜的發(fā)展始于20世紀(jì)60年代，由于其具有分離和分析的雙重功能，且有很高的選擇性和較高的靈敏度，因而可同時分析結(jié)構(gòu)相似的藥物和代謝物等。色譜法中以高效液相色譜法最為常用，因其克服了經(jīng)典液相色譜法柱效低，分離時間很長的缺點(diǎn)，成為一種高效、快速的分離技術(shù)。特別是反相高效液相色譜法（RP-HPLC）更具有試劑價廉、方法簡單和適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為體內(nèi)藥物分析方法中最重要的方法，并常作為體內(nèi)藥物分析中評價其它方法的參比方法。

1.2 高效液相色譜的特點(diǎn) ①高壓；②高速；③高效；④高靈敏度；⑤適應(yīng)范圍寬。

1.3 高效液相色譜分類 高效液相色譜法按分離機(jī)理的不同可分為以下幾類：①吸附色譜法，以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法；②液-液分配色譜法，液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)（K）的不同而被分離；③離子交換色譜法離子對交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離；④空間排斥色譜法，空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)，即凝膠；⑤親和色譜法，親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法；⑥手性色譜法，不少有機(jī)藥物的結(jié)構(gòu)中有不對稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋光性。立體構(gòu)型不同的一對對映體，其藥效、毒副作用往往不相同。

2 在藥物分析中的應(yīng)用

在藥物分析中，高效液相色譜已成為各類藥物及其制劑進(jìn)行鑒別、檢查、雜質(zhì)分離及含量測定的重要手段。

2.1 在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中，由于保留時間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，不同的藥物由于結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異在譜圖上出峰順序不同，因而根據(jù)這定性的參數(shù)可用于藥物的鑒別。如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定：在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照品主峰的保留時間一致。

2.2 在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 在HPLC分離檢測中的保留時間不同，用HPLC對藥物鑒別和雜質(zhì)檢查，具有較強(qiáng)的專屬性，HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛。藥物中有關(guān)雜質(zhì)主要是藥物中存在的合成原料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測。

2.3 在含量測定中的應(yīng)用 色譜圖面積與濃度呈線性關(guān)系是其可以定量測定的依據(jù)。高效液相色譜法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，在藥物含量測定中的應(yīng)用十分廣泛。如中國藥典中合成藥及其制劑，用其測定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾。中藥材及其制劑組成復(fù)雜，其中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了高效液相色譜法。

2.3.1 常用藥物分析中的應(yīng)用 常用藥物系指解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、心血管藥等。HPLC能很好的分離這些藥物中的各種有效成分。例如，中國藥典記錄的阿斯匹林、非那西丁、咖啡因的含量測定。

2.3.2 甾體藥物分析中的應(yīng)用 甾體藥物主要是指甾醇的衍生物，其可分為腎上腺皮激素、雄性激素、雌性激素和孕激素。各類型的甾體藥物都可以用HPLC成功的分離。例如炔諾孕酮用內(nèi)標(biāo)法測定含量。

2.3.3 抗菌素類藥物分析中的應(yīng)用 抗菌素種類繁多，臨床應(yīng)用廣泛，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可分為B_內(nèi)酰胺類抗菌素、氨基糖苷類抗菌素、四環(huán)素類抗菌素、氟喹諾酮類抗菌素等。HPLC分析技術(shù)近年來在抗生素的質(zhì)量控制中已廣泛應(yīng)用。對結(jié)構(gòu)、組分等較清楚的藥物，HPLC分析將逐步取代傳統(tǒng)的生物測定。目前，各國藥典中應(yīng)用HPLC技術(shù)對抗生素進(jìn)行質(zhì)量控制的項(xiàng)目包括鑒別、組分分析、含量測定和相關(guān)物質(zhì)測定等。如青霉素有效成分的分離可采用反相鍵合色譜法，硫酸慶大霉素C組分的含量測定。

2.3.4 手性藥物分析中的應(yīng)用 兩種化學(xué)組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，或稱為手性化合物。由于對映體的物理、化學(xué)性質(zhì)相同，實(shí)現(xiàn)它們的分離就比較困難，如大多數(shù)氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。對于手性藥物往往呈現(xiàn)一種對映體具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無效。手性藥物HPLC法現(xiàn)已成為手性藥物質(zhì)量控制和新藥研發(fā)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。如對酮康唑外消旋體采用C18鍵合固定相，以磺丁基-B-環(huán)糊精為手性流動相添加劑進(jìn)行拆分而使酮康唑的右旋體和左旋體得以分離。

2.4 生物藥物分析中的應(yīng)用 生物藥物是從動、植物、微生物中提取的、生物-化學(xué)半合成的或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物。包括生化藥物和生物制品等。例如中國藥典對重組人生長激素、重組人胰島素、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的鑒別。

2.5 在血藥濃度檢測中的應(yīng)用 藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布，可形成一定的血藥濃度，利用高效液相色譜法可監(jiān)測藥物的血藥濃度，保證用藥安全。如對乙酰氨基酚急性中毒的血藥濃度的檢測：對乙酰氨基酚是臨床上使用極其廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，由于患者狀態(tài)的多樣性以及對酰氨基酚中毒的早期癥狀與胃潰瘍癥狀極其相似且肝功正常，故常常發(fā)生漏診，等到發(fā)生肝損傷已經(jīng)錯過了治療最佳時機(jī)。因此，國外已將對乙酰氨其酚血濃度作為急診中毒病人常規(guī)檢測。色譜條件：采用Nova-PakC18柱（4μm，150mm×3.9mm），柱溫25℃；流動相為甲醇-水（30：30），流速為0.8ml/min；二極管陣列檢測器，檢測波長254nm。血漿樣品制備；取靜脈血3ml-4ml，置含肝素抗凝劑的離心管中，離心分離5min（3000r/min），上清液為待測血漿。取上述血漿1ml，加飽和硫酸鋅溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，渦漩混合1min，離心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮?dú)饬鞔蹈桑渲潦覝?，以蒸餾水500μl溶解殘?jiān)?，?0μl進(jìn)樣。對照品溶液制備；配制對乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐級稀釋成濃度為0.01mg/ml-5mg/ml的對照品溶液，4℃冰箱存放備用。血漿中對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備；取肝素抗凝的血漿1ml，分別加入不同濃度的對乙酰氨基酚工作液100μl，使血漿中藥物濃度為0.9μg/ml-454.5μg/ml，再按“血漿樣品制備”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，以溶液C對峰面積A作線性回歸，得回歸方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，線性范圍為0.9μg/ml-454.5μg/ml，最低檢測濃度為0.9μg/ml（以信噪比≥3計(jì)）。用HPLC測定可疑中毒病人血中對乙酰氨基酚濃度具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，可有效地幫助臨床醫(yī)生確診，快速有效地救治患者，對提高醫(yī)療質(zhì)量有重要意義。

2.6 天然藥物分析中的應(yīng)用 由于天然藥物的化學(xué)成分復(fù)雜，對于控制藥品質(zhì)量，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來說比較困難，HPLC可通過對天然藥物的有效成分進(jìn)行分離鑒定，再測定有效成分的含量；通過指紋圖譜建立識別模式，可以判定藥材的質(zhì)量高低。

3 高效色譜法在藥物分析的研究動向及應(yīng)用進(jìn)展

3.1 檢測手段的進(jìn)步 近年來，高效液相色譜教重要的發(fā)展方面是檢測器的發(fā)展，如二極管陣列檢測器和高效液相蒸發(fā)激光散射檢測器，可以用高效液相二極管陣列檢測器分離檢測銀杏等葉中黃酮成分，用高效液相蒸發(fā)激光散射檢測器測定銀杏葉提取物中內(nèi)酯的含量等。儀器的進(jìn)一步發(fā)展，HPLC在藥物分析中會成為更加有效的高靈敏度的方法和可操作性。

3.2 二（多）維色譜 為了從復(fù)雜樣品中分離或定量某一特定成分，可采用兩種或兩種以上的不同的色譜方法，即采用二維或多維色譜，多維色譜能夠靈活應(yīng)用傳統(tǒng)HPLC，在復(fù)雜生物樣品的分析中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.3 色譜技術(shù)的聯(lián)用 目前，對某一復(fù)雜樣品的分析很難用單一分析分離方法解決，使用HPLC聯(lián)用技術(shù)是發(fā)展趨勢之一。如液相色譜—質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用可用于藥物代謝研究、天然產(chǎn)物快速分析以及生物大分子分析

3.4 微液相色譜的研究 由于微液相色譜分析所需的樣品量及流動相的消耗大大下降，檢測靈敏度又大大提高，相信此法在藥物分析中也能發(fā)揮它的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論和展望

綜上所述，HPLC是現(xiàn)代分離測定的重要手段。由于它具有專屬性強(qiáng)、簡便快速、靈敏度高等特點(diǎn)，既可用于分離也可用于定量分析，適用于各種各樣的有機(jī)化合物，因此目前在藥物成分的分離與測定方面得到了廣泛的應(yīng)用。相信隨著檢測手段的進(jìn)步、各種聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)以及其他一些相關(guān)問題的解決，HPLC在醫(yī)藥研究中將會發(fā)揮越來越重要的作用。

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