“綠葉中色素的提取”實驗改進(jìn)

姚梁

筆者負(fù)責(zé)高中階段的生物實驗工作，在長期指導(dǎo)高中學(xué)生做“綠葉中色素的提取和分離”實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)即使是規(guī)范的實驗操作后，仍有部分學(xué)生在最終的實驗結(jié)果中只能看到三條色素帶，另外一條很模糊甚至不能觀察到。刨去實驗操作的誤差后，筆者苦思冥想，問題的癥結(jié)在哪里？筆者把目光放到色素的提取量上，是否是色素提取量不夠多？能否在高中提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)或者改造，提高色素的提取量，以便能更快速、高效地提取出色素？

這項實驗的關(guān)鍵是提高色素的提取率，提取色素的原理是色素會溶于有機(jī)溶劑中，普通高中課程生物實驗中提取色素所用的有機(jī)溶劑是100%乙醇10ML。那么其他常見有機(jī)溶劑的提取效果是否更好？光下操作和黑暗下操作結(jié)果是否一致？重新梳理了下實驗思路之后，筆者閱讀和查看了大量的文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)提取色素常見的方法有：浸提法（soaking）和Arnon法。Arnon這個方法提出的時間較早，要點是將待測定的綠色材料用80%的丙酮溶液研磨并提取，經(jīng)過過濾或者是離心后，再用分光光度法測量綠色材料的光密度值，但是也有缺點：提取麻煩，操作復(fù)雜，研磨和去殘渣很耗時，這樣就不可避免會暴露在陽光下，使得色素被分解，對操作的要求也比較高，造成誤差。浸提法是由Shoaf和Hiscox等人提出來的，是最早想到用化學(xué)物質(zhì)（二甲亞砜）浸提色素，這樣避免了Arnon需要過濾離心等復(fù)雜操作，使得提取更簡單準(zhǔn)確，但是由于提取時間長，要看不同材料，以葉片變白為止，一般浸提時間至少需要0.5小時到2小時，有的甚至更長。溫度還要維持在65°C，并且二甲亞砜有難聞的臭味且不好保存，成本高，所以該法經(jīng)過改進(jìn)，現(xiàn)在一般不用二甲亞砜，用其他的有機(jī)溶劑代替，比如陳福明、張憲政提出用混合液浸提法提取和測定色素的量，比如提取液單獨用乙醇、丙酮、甲醇，后來還發(fā)展成有機(jī)溶劑進(jìn)行混合配比，比如丙酮：乙醇=1：1，丙酮：乙醇：水=5：5：1，丙酮：甲醇=1：1等不同比例的混合液，嘗試哪種混合比例為最佳。

我們都知道，光對色素來說具有破壞作用，高中實驗課“綠葉中色素的提取”方法步驟中并沒有要求避光操作，那是否有無光照是個無關(guān)變量，有沒有影響色素的提取量？帶著這些問題，筆者綜合考慮上述因素，結(jié)合實驗室實際情況，試著在高中實驗方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，通過設(shè)置分組對照，對比不同有機(jī)溶劑及其混合液（由于實驗室條件限制，選取丙酮：乙醇=1：1）和光照對色素提取的影響，用分光光度法定量測葉綠素含量，間接反映色素的量的方法進(jìn)行實驗。

一、實驗部分

1.實驗材料、主要儀器和試劑

新鮮菠菜葉，研缽，SP2000型可見分光光度計，SiO2，CaCO3，按體積比配制不同的提取液（乙醇10ML，丙酮10ml，甲醇10ML，均為分析純）。

2.實驗方法

（1）將試管均分成8組，每組分組編號，4組處于自然光下實驗A1，A2，A3，A4，另4組處于昏暗處實驗B1，B2，B3，B4。

（2）將菠菜葉洗凈擦干，用剪刀在菠菜相同葉片位置取材（避開葉片莖稈），剪碎混勻，每組5g，放在各個研缽中。

（3）向8個研缽中放入少許等量SiO2，CaCO3，再分別加入提取液如下表：

■

（4）等速研磨3分鐘。

（5）將每組研磨液迅速進(jìn)行過濾，將濾液收集到試管中，塞緊試管口。

（6）用SP2000型分光光度計測葉綠素的含量，試測3次后，等待光吸收值穩(wěn)定下來，再測量并計算葉綠素的含量，重復(fù)3次，求平均值，并在340～710光波段掃描吸收光譜并制圖。葉綠素含量用Arnon法的公式：

葉綠素a=（12.7A664-2.69A646）×■

葉綠素b=（12.7A646-2.69A664）×■

葉綠素總量=（20.0A646+8.02A664）×■

或葉綠素總量=■×■

其中A664，A646，A651分別為對應(yīng)波長的光密度值，V為綠葉材料提取液的體積，W為綠葉的鮮重。

3.結(jié)果分析

（1）葉綠素的吸收光譜比較

■

圖1 8組不同葉綠素提取液吸收光譜圖

（A1，A2，A3，A4畫實線；B1，B2，B3，B4畫虛線）

圖1表明，8組實驗吸收光譜曲線總體相似，波峰集中在430nm～445nm和660nm～670nm之間，波谷集中在554nm和606nm左右，說明不同提取液對菠菜吸收光譜的影響微弱。同時，不管是在光照下，還是在昏暗條件測量，8種葉綠素提取液的吸收光譜曲線也大體相似，說明是否有光對葉綠素吸收光譜的影響不大。

（2）不同提取液提取葉綠素的含量比較

表1 不同條件，不同提取液提取葉綠素的動態(tài)變化

■

分析表1結(jié)果，從數(shù)據(jù)的量來看，菠菜提取量的區(qū)分度差別不大，但是還是可以看到一些細(xì)微的區(qū)別和規(guī)律，具體體現(xiàn)在兩點上：

一是總體觀察表1，我們發(fā)現(xiàn)一個規(guī)律，不管是葉綠素a、葉綠素b，還是總?cè)~綠素的量，An大于Bn，昏暗下提取的葉綠素的量比光下提取的量要更多些，這也就是說明：光對葉綠素的提取有破壞作用，在無光條件下提取量更多，所以，有條件的話最好在昏暗或者黑暗環(huán)境下進(jìn)行操作，這樣提取的色素量更多。

二是通過數(shù)據(jù)分析，對比不同提取液的提取效率，可以看出，乙醇：丙酮=1：1的提取液提取出來葉綠素量最多，效果最佳，課本中的例子乙醇提取效果次之，然后是丙酮，最后是甲醇。這說明：課本中的實驗有改進(jìn)的可能，有機(jī)溶劑乙醇不一定提取效率最高。當(dāng)然，對于本次實驗來講，由于條件的限制，對于混合液的種類和比例，筆者的選擇標(biāo)準(zhǔn)是高中階段常見的3種有機(jī)溶劑及其比例，在這個效果下選出最佳。實際中，可能還有其他更優(yōu)的配比還沒找到，筆者試著給生物實驗工作提供一個思路，希望能提高提取效率。

當(dāng)然，通過對表格提取量的定量分析，對高中生物實驗而言，這些提取量數(shù)據(jù)區(qū)分度也不算特別明顯。我們在做生物實驗的時候，除了要考慮提取量之外，還要考慮到操作的簡易程度和各個學(xué)校的實際情況，盡量做到操作和效果上的平衡。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳福明，陳順偉.混合液法測定葉綠素含量的研究[J].林業(yè)科技通訊，1989（5）：77-78.

[2]張憲政.植物葉綠素含量測定-丙酮乙醇混合液法[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986（2）：4-8.

[3]蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較[J].植物生理學(xué)通訊，1989（5）：77-78.