小黑楊玃sneIF5A2/4基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草中的轉(zhuǎn)化研究

趙思雯　 鄭唐春　 臧麗娜等

摘要 [目的]研究楊樹(shù)eIF5A基因的功能，為林木抗性育種研究提供參考。[方法]構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉盤(pán)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行分子水平鑒定。[結(jié)果]楊樹(shù)eIF5A基因已經(jīng)整合入煙草基因組中，且轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草葉片抗重金屬能力提高。[結(jié)論]楊樹(shù)eIF5A基因能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草的抗脅迫能力，為林木抗逆育種機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 楊樹(shù)（Populus spp.）；eIF5A；煙草；脅迫

中圖分類號(hào) Q786；S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02286-05

Construction of Plant Expression Vector Containing PsneIF5A2/4 Genes of Populus simonii×Populus nigra and Its Genetic Transformation in Tobacco

ZHAO Siwen，QU Guanzheng et al （State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To find the gene functions of eIF5A of Populus simonii×Populus nigra and to lay the theoretical foundation for resistant breeding of forest trees. [Method] The eIF5A genes were constructed in plant expression vector and transformed into tobaccos using agrobacteriummediated procedure. Then， the transgenic tobaccos were identified by PCR. [Result] The eIF5A genes were integrated into the genome of tobacco and the transgenic tobaccos all improved viability under heavy metal stress when comparing with the wild type tobacco. [Conclusion] The eIF5A genes have a potentiality to improve viability under a biotic stresses in transgenic plants， and they lay the theoretical foundation of tree breeding for stress tolerance.

Key words Populus spp.； eIF5A； Tobacco； Stress

真核生物的翻譯起始因子5A（Eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A）是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一一個(gè)含有hypusine殘基的蛋白質(zhì)。eIF5A蛋白對(duì)hypusine的修飾是其發(fā)揮功能、細(xì)胞存活和增殖所必須的[1-2]。eIF5A在蛋白質(zhì)合成起始起作用，通過(guò)促進(jìn)一些特異mRNA 的轉(zhuǎn)移及相關(guān)特異基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、衰老、死亡，或者產(chǎn)生環(huán)境脅迫的應(yīng)答和抵抗能力[3]。例如，Liu等發(fā)現(xiàn)擬南芥eIF5A1對(duì)木質(zhì)部形成有促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)基因擬南芥木質(zhì)部比對(duì)照含量高出1倍[4]；而擬南芥eIF5A2是引起細(xì)胞程序死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一個(gè)關(guān)鍵因素，擬南芥eIF5A2能夠調(diào)控由有毒力的Pst DC3000侵染所引起的細(xì)胞程序死亡[5]。從目前的研究來(lái)看，大多數(shù)的eIF5A主要克隆于模式植物（如擬南芥）和其他甜土植物（如水稻、玉米和小麥等），而克隆于木本植物的eIF5A基因研究鮮有報(bào)道。

楊樹(shù)（Populus spp.）是一種分布廣、適應(yīng)強(qiáng)、周期短和需求大的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，不僅是發(fā)展人工林是解決木材短缺的重要途徑之一，同時(shí)也是木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物[6]。課題組前期已經(jīng)對(duì)毛果楊中4個(gè)eIF5A基因的生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，并且利用釀酒酵母初步研究轉(zhuǎn)小黑楊eIF5A基因酵母在不同非生物脅迫下的抗性[7-8]。筆者通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，并進(jìn)行重金屬離子脅迫，以期為進(jìn)一步開(kāi)展楊樹(shù)eIF5A基因在逆境脅迫中的作用和利用基因工程手段提高重要經(jīng)濟(jì)林木抗性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。楊樹(shù)，采自東北林業(yè)大學(xué)校園多年生小黑楊雄株；野生型煙草（Nicotiana tabacum），由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑。植物表達(dá)載體prok II質(zhì)粒，由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA marker、PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA ligase，購(gòu)自TaKaRa公司；pEasyT1載體和EasyPure Plant RNA Kit，購(gòu)自全式金公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.1.3 供試菌種。大腸桿菌DH5α感受態(tài)，購(gòu)自天根生化科技有限公司；農(nóng)桿菌菌株EHA105，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 小黑楊PsneIF5A基因的克隆 用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取小黑楊幼葉的總RNA，檢測(cè)純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以單鏈cDNA為模板，利用表1中克隆基因的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 通過(guò)表1中構(gòu)建載體的引物擴(kuò)增目的片段，連接pEasyT1載體后，送華大公司測(cè)序。測(cè)序成功后，分別利用限制性內(nèi)切酶Xba I、Sac I雙酶切pEasyT1PsneIF5A2、pEasyT1PsneIF5A4和prok II質(zhì)粒，分別回收目的片段后，利用T4DNA連接酶連接后從而得到prok IIPsneIF5A2和prok IIPsneIF5A4植物表達(dá)載體，提取質(zhì)粒送北京華大公司測(cè)序。測(cè)序成功后，采用液氮凍融法將prok IIPsneIF5A2和prok IIPsneIF5A4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.4 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 參考律鳳霞和趙勤的煙草轉(zhuǎn)化方法[9-10]：①無(wú)菌操作下，將菌液（OD600=0.6）轉(zhuǎn)入離心管中離心5 min（3 000 r/min），棄去上清液，將收集到的菌體用無(wú)菌水稀釋至終濃度的OD600在0.2～0.3，即可作為侵染用菌液；②無(wú)菌操作下，將切成長(zhǎng)寬1.0 cm大小的煙草葉片，在侵染液中浸泡2～3 min，輕輕搖晃侵染液，然后用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液；③將侵染過(guò)的葉片在不含抗生素的分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA）上培養(yǎng)，（25±2）℃暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2 d；④將共培養(yǎng)的葉片在含有200 mg/L的頭孢霉素溶液中清洗3～5 min，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分后，將葉片放在含有相應(yīng)抗生素的分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢霉素）上培養(yǎng)。第1周每隔2 d脫菌1次，之后每7 d脫菌1次，直至分化出小芽；⑤待抗性芽長(zhǎng)成葉片后，將葉片切下在含有抗生素的分生培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行2次篩選分化；⑥待2次分化的不定芽長(zhǎng)到1.0 cm左右，切下，移入含抗生素的生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)（MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢霉素）。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè) CTAB法提取篩選后的煙草株系葉片DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性株系。利用表1中prok II通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；再于72 ℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后取3 μl反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 轉(zhuǎn)基因煙草株系耐重金屬Cd2+試驗(yàn) 選取經(jīng)PCR初步檢驗(yàn)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，切取長(zhǎng)勢(shì)相同的轉(zhuǎn)基因與野生型煙草葉片，放置在含有300 μmol/L的CdCl2的MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察煙草葉片對(duì)重金屬離子的耐受性。每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊PsneIF5A基因的克隆 圖1A表明，利用RNA提取試劑盒，從小黑楊組培苗中成功提取總RNA，經(jīng)檢測(cè)濃度及質(zhì)量均可用于下一步試驗(yàn)。圖1B表明，以花芽總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，成功克隆到2條eIF5A基因序列，暫時(shí)命名為PsneIF5A2（GenBank No.KC521463）和PsneIF5A4（GenBank No.KC521464）。通過(guò)對(duì)核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這2條同源基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）均為483 bp，共預(yù)測(cè)編碼160個(gè)氨基酸。通過(guò)ExPASY網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）在線分析，預(yù)測(cè)2條同源基因編碼蛋白的分子量大約為17.5 kDa，等電點(diǎn)pI為5.60。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證 利用限制性內(nèi)切酶Xba I、Sac I雙酶切pEasyT1PsneIF5A2、pEasyT1PsneIF5A4和prok II質(zhì)粒，分別回收目的片段后，利用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而得到prok IIPsneIF5A2和 prok IIPsneIF5A4重組質(zhì)粒（圖2 A～B）。分別挑取3個(gè)單克隆進(jìn)行初步的質(zhì)粒PCR檢測(cè)，獲得700 bp左右目的條帶（圖2 C）。抽提質(zhì)粒送公司測(cè)序結(jié)果顯示，小黑楊PsneIF5A基因分別整合到植物表達(dá)載體prok II中，未發(fā)生堿基突變，至此植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。采用液氮凍融法將prok IIPsneIF5A2和 prok IIPsneIF5A4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（圖2 D）。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及驗(yàn)證 用含有prok IIPsneIF5A的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化煙草葉片后，經(jīng)4～5周的選擇培養(yǎng)，從葉片周圍的愈傷組織分化出綠色或淡綠色的抗性芽。將抗性芽分割后培養(yǎng)，繼而獲得大量從生芽（圖3 A）。待叢生芽長(zhǎng)出葉片后，將葉片切下在含有抗生素（50 mg/L卡那霉素）的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行2次篩選（圖3 B）。將2次分化獲得的芽在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根定植，獲得完整轉(zhuǎn)基因煙草植株（圖3 D）。提取生根植株煙草葉片基因組DNA，利用載體prok II的通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，在檢測(cè)的6株抗性煙草植株中，均擴(kuò)增出了大小為700 bp左右片段，而以野生型煙草為對(duì)照的反應(yīng)，未擴(kuò)增出條帶，因此推測(cè)外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中（圖3 C）。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的耐重金屬Cd2+試驗(yàn) 挑選長(zhǎng)勢(shì)相同的轉(zhuǎn)基因及野生型煙草進(jìn)行Cd2+脅迫試驗(yàn)，同時(shí)選取多個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系重復(fù)3盤(pán)以上。當(dāng)Cd2+脅迫濃度為600 μm/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草均在培養(yǎng)1 d后，葉片均失綠、透明化，并死亡（數(shù)據(jù)未展示）。當(dāng)Cd2+脅迫濃度為300 μm/L時(shí)，在培養(yǎng)后的第3天，野生型煙草葉片出現(xiàn)傷口損傷加重，葉片稍微透明化等現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因葉片則能正常的吸收水分，葉片膨大（圖4 A）；在培養(yǎng)后的第5天，野生型煙草葉片失綠、透明化嚴(yán)重，并死亡，而轉(zhuǎn)基因葉片僅僅表現(xiàn)為稍微變黃，仍能進(jìn)行分化生長(zhǎng)（圖4 B）。上述結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草的耐重金屬Cd2+能力提高。

3 結(jié)論與討論

研究表明，植物eIF5A基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著的重要作用[11-12]。先前已有研究報(bào)道，水稻eIF5A基因受鹽脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)[13]，檉柳eIF5A基因在轉(zhuǎn)基因酵母中對(duì)鹽及滲透脅迫具有抗性[14]。初步說(shuō)明，eIF5A基因與非生物脅迫有關(guān)。前期的研究也表明，楊樹(shù)eIF5A基因轉(zhuǎn)酵母對(duì)鹽和滲透脅迫并未表現(xiàn)出明顯差異，而是在Cu2+、Cd2+、Zn2+等重金屬離子脅迫下差異明顯，這說(shuō)明該基因在植物體內(nèi)可能參與多種非生物脅迫響應(yīng)途徑[8]。試驗(yàn)將楊樹(shù)eIF5A轉(zhuǎn)化煙草，證明轉(zhuǎn)eIF5A基因煙草在Cd2+脅迫下，具有明顯差異。對(duì)其他非生物脅迫的試驗(yàn)正在有序的驗(yàn)證中，但結(jié)果和在酵母體內(nèi)驗(yàn)證存在一定的差異，這可能是因?yàn)槲锓N不同造成的。在植物中，已有文獻(xiàn)表明eIF5A基因具有多種異構(gòu)體，各種異構(gòu)體分別承擔(dān)不同的生物學(xué)功能，共同完成調(diào)控生物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及環(huán)境適應(yīng)等的功能[15-16]。試驗(yàn)克隆出的2條小黑楊eIF5A基因，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比對(duì)分析表明這2條基因也僅有3個(gè)氨基酸上的差異，推測(cè)這2條基因在楊樹(shù)中高度保守，且在功能上存在互補(bǔ)作用。根據(jù)這2條基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的對(duì)重金屬離子的耐受性結(jié)果也表明，這2條基因在功能讓存在冗余，這可能是因?yàn)闂顦?shù)基因組形成時(shí)的局部加倍造成的。

為緩解重金屬造成的污染，研究人員已開(kāi)始利用植物基因工程進(jìn)行植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用，以期提高植物的耐重金屬能力。試驗(yàn)通過(guò)研究楊樹(shù)eIF5A基因在煙草中的耐重金屬離子脅迫，發(fā)現(xiàn)該類基因能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐受性，這具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為后期的林木優(yōu)良基因的鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

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