東方伊薩酵母菌對偶氮染料酸性大紅GR的脫色優(yōu)化及特性研究

盧婧 余志晟 張洪勛

摘要 [目的]優(yōu)化東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis YP1）對偶氮染料酸性大紅GR的脫色條件，初步闡明脫色機理。[方法]研究該菌在不同溫度、pH、接種量、染料起始濃度、碳源和氮源條件對酸性大紅GR的脫色影響，并且對脫色降解功能酶進行定位。[結(jié)果]該菌在16 h內(nèi)對濃度為50～100 mg/L酸性大紅GR的脫色率達(dá)96%，其機理主要為降解脫色。東方伊薩酵母菌YP1的最佳接種量不應(yīng)低于10%，最佳pH 在4～8之間，最佳溫度為28 ℃，（NH4）2SO4濃度在0.1% 以上，葡萄糖濃度不應(yīng)低于1%。脫色后染料的主體結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生降解反應(yīng)。該菌主要脫色降解功能酶為胞內(nèi)酶。 [結(jié)論]東方伊薩酵母菌對酸性大紅GR的脫色效果顯著，在染料廢水處理中將具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 酵母菌；東方伊薩酵母菌 YP1；偶氮染料；降解脫色

中圖分類號 S187；X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02233-04

The Decolorization Optimization and Characteristics of an Azo Dye Acid Scarlet GR by Yeast Issatchenkia orientalis YP1

LU Jing， YU Zhisheng et al

（College of Resources and Environment， University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049）

Abstract [Objective] The study aimed to discuss the optimal conditions and preliminary decolorization mechanism for the decolorization and degradation of azo dye Acid Scarlet GR by yeast strain Issatchenkia orientalis YP1. [Method] The effect of different temperatures， pH， inoculation volumes， initial dye concentrations， carbon and nitrogen concentrations on decolorization with I.orientalis YP1 was discussed in detail， as well as its preliminary decolorization mechanism. [Result] This strain achieved a maximal decolorization （96%） for Acid Scarlet GR （50-100 mg/L） after incubation for 16 h. To get such decolorization， the optimal inoculation volume of this strain was set not less than 10%， optimal pH of culture medium ranging from 4 to 9， and concentrations of （NH4）2SO4 and glucose not lower than 0.1% and 1%， respectively. In addition， the results showed that the main structure of acid scarlet GR was destroyed after decolorization and the main functional decolorization enzyme was intracellular enzyme. [Conclusion] The yeast strain Issatchenkia orientalis YP1 has relatively strong decolorization capability on azo dye acid scarlet GR， which has a good prospect in the biodegradation of dye wastewater.

Key words Yeast； Issatchenkia orientalis YP1； Azo dye； Decolorization and degradation

染料廢水屬于一類持久性難降解有機廢水，已成為環(huán)境重點污染源之一。利用微生物強化處理技術(shù)進行染料污染治理被認(rèn)為是去除這些污染物的最為經(jīng)濟、有效的方法，在處理工業(yè)廢水、染料廢水等方面已得到廣泛的應(yīng)用。高效脫色降解菌的篩選、脫色條件優(yōu)化以及脫色機理的研究已成為國內(nèi)外含染料廢水生物處理技術(shù)的一個重要內(nèi)容。染料微生物脫色降解機理復(fù)雜且多樣，有些機制仍不明確，但是普遍認(rèn)為染料的微生物降解是在多種酶的協(xié)同作用下完成的。為了解脫色酶的性質(zhì)及其應(yīng)用于實際廢水處理的可能性，筆者選用合成染料中最廣泛、用途最大的一類偶氮染料為研究對象，在實驗室前期研究工作的基礎(chǔ)上初步探討東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR最佳脫色條件和機理。

1 材料與方法

1.1 染料與菌株

酸性大紅GR購自天津彩麗染料有限公司。東方伊薩酵母菌YP1由本實驗分離、保存。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基（液體，1 L）：蛋白胨20 g，酵母粉10 g，氯化鈉20 g，瓊脂20 g，pH 6.0；脫色培養(yǎng)基 （液體，1 L）：葡萄糖2 g，酵母粉1 g，氯化鈉2 g，加水至1 L，pH 6.0；染料培養(yǎng)基：在脫色培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入一定濃度的染料，一般情況下為100 mg/L。

1.3 菌體生長曲線的測定

將東方伊薩酵母菌懸液1 ml 接種到100 ml 脫色培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，分別在4、8、12、16、20、24、36 h取樣，用UV4802H 型紫外可見光分光光度計測定菌株的OD560值[1]。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D560值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。

1.4 脫色條件優(yōu)化

在28 ℃下，將已純化好的東方伊薩酵母菌YP1在活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取一環(huán)已活化的酵母于150 ml 染料培養(yǎng)基中，200 r/min，28 ℃，搖瓶培養(yǎng)16 h。在不同溫度、pH、接種量、染料起始濃度、碳源和氮源條件下，研究菌株對酸性大紅GR的最佳脫色條件。

1.5 脫色率分析計算方法

取3 ml 脫色培養(yǎng)液于離心管中，8 000 r/min 離心20 min，取上清液用分光光度計測定其在酸性大紅GR 最大吸收波長505 nm處的OD值，以不接酵母菌的脫色培養(yǎng)液為對照（CK），計算脫色率[2]。

脫色率（%）=（A-B）/A×100

式中，A為脫色前脫色培養(yǎng)液的OD 值；B為脫色后脫色培養(yǎng)液的OD值。

1.6 降解產(chǎn)物紫外-可見光連續(xù)掃描分析

將不同時段取樣的50 mg/L 脫色液于8 000 r/min 離心20 min，取上清液進行紫外-可見動態(tài)掃描，分析菌株對染料的動態(tài)降解及產(chǎn)物生成情況。

1.7 脫色酶系的定位

1.7.1 上清液脫色試驗。將已完全脫色的含染料培養(yǎng)液離心（8 000 r/min，20 min），取上清液5 ml移入150 ml染料培養(yǎng)基中，置于搖床中（200 r/min，28 ℃），定期測定溶液的染料吸光度。

1.7.2 粗酶液脫色試驗。將已完全脫色的液體染料培養(yǎng)基離心收集菌體（8 000 r/min，20 min），用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗滌2次，再用相同的緩沖液重懸沉淀菌體，冰浴超聲波破碎細(xì)胞40 min（400 W，3s/3s），4 ℃下12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，取上清液2 ml，移入150 ml 染料液體培養(yǎng)基中，置于搖床（200 r/min，28 ℃），定期測定溶液的染料吸光度。

1.7.3 對照組脫色試驗。設(shè)置一組既未破碎且未離心的染料脫色培養(yǎng)液與上清液組和菌體破碎組作對照（CK）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定

由圖1可知，酵母菌生長曲線基本符合S型生長曲線模型，與傳統(tǒng)的S 型比較起來對數(shù)生長期短，達(dá)到生長穩(wěn)定期的時間延長。在0～4 h為生長延遲期，在4～16 h 為對數(shù)生長期，在16～36 h為穩(wěn)定期，36 h后為衰亡期。在12 h時，東方伊薩酵母菌YP1生長最旺盛，且處于對數(shù)期，此時最適于接種。

圖1 東方伊薩酵母菌YP1的生長曲線

2.2 不同條件對酸性大紅GR脫色的影響

2.2.1 溫度和pH。

溫度是影響微生物生長的重要因素之一。溫度主要通過影響酶的活性來影響微生物的生長速率和對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝速率。不同菌種的適宜溫度不同[3]。該研究按10%接種量，將菌懸液接入脫色培養(yǎng)基中（染料質(zhì)量濃度為100 mg/L），分別于20、28、37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，測定吸光度值。由圖2可知，該菌株在3個溫度24 h內(nèi)都能達(dá)到較高的脫色率，達(dá)96% 以上。但是，在28 ℃條件下脫色速率最快，4 h內(nèi)達(dá)83%，說明該菌體產(chǎn)生的酶在此溫度具有較高的酶活性。因此，溫度選取在28 ℃最佳。

圖2 溫度對脫色率的影響

由圖3可知，不同pH條件下東方伊薩酵母菌YP1在培養(yǎng)24 h 后對酸性大紅GR脫色有效果，東方伊薩酵母菌YP1對pH的適應(yīng)范圍較廣。在測試的pH范圍內(nèi)，它都具有一定的脫色效果，最適pH 在4～8之間。當(dāng)pH偏酸為2時脫色率較低，只有57%。研究表明，偶氮染料的微生物脫色最佳pH范圍通常在6～10[4-6]，但有的微生物對pH的適應(yīng)范圍較窄，pH過高或過低都可能對脫色菌的生長造成不利影響。pH對脫色率的影響主要是通過影響酶的構(gòu)象及電子傳遞過程，導(dǎo)致菌種對染料的脫色發(fā)生變化[7]。

圖3 pH對脫色率的影響

2.2.2 接種量。

由圖4可知，隨接種量的增加，脫色效率越快。這是因為每單位體積染料與微生物接觸的概率增大，越有利于菌體對染料的脫色。當(dāng)接種量為10%（V/V）時，8 h即可達(dá)到95%以上的脫色率。而不同的接種量均可在16 h達(dá)到95%以上的脫色率，即在16 h后接種量對東方伊薩酵母菌YP1脫色的影響可以忽略。為了增加菌體對酸性大紅GR的適應(yīng)性，且不因接種量過大而降低染料的初始濃度，后續(xù)試驗均以10% 的接種量來對染料脫色進行研究。

圖4 接種量對脫色率的影響

2.2.3 酸性大紅GR起始濃度。

由圖5可知，在接種量為10%、28 ℃、pH 7 下?lián)u床培養(yǎng)36 h，東方伊薩酵母菌YP1對不同起始濃度酸性大紅GR脫色率有明顯的差異。酵母菌脫色的速率隨染料濃度的增加而降低，達(dá)到最大脫色率的時間依次推后。研究表明，50、100 mg/L的染料較適合東方伊薩酵母菌YP1的生長且具有高效的脫色作用，達(dá)到最大脫色率96%的時間不超過24 h，并且染料顏色接近無色，離心后的菌體為乳白色（不帶酸性大紅GR的紅色）。推測該狀態(tài)的脫色機制，可能為生物降解作用。在濃度為200 mg/L以上時，東方伊薩酵母菌YP1的生長開始受到抑制，啟動較慢，離心后菌體呈現(xiàn)紅色。此時，酵母菌對染料的脫色除了降解以外，還有吸附作用。在培養(yǎng)48 h 后，高于600 mg/L 的染料培養(yǎng)基脫色率仍小于18%，但仍有增加的趨勢。隨著染料濃度的增大，染料吸附量增大，染料對酵母菌的毒性增大，抑制了該菌的生長速率和脫色活性。總體而言，東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR有良好的降解效應(yīng)，對環(huán)境有較強的適應(yīng)能力和耐沖擊能力。與一些細(xì)菌、絲狀真菌和其他酵母菌[8-12]相比，東方伊薩酵母菌YP1對染料進行脫色的能力和速率均具有明顯的優(yōu)勢。

為了便于研究其他條件對脫色的影響，確定以100 mg/L 的染料進行后續(xù)試驗，因為該濃度在實際染料廢水中該濃度已較高。

圖5 染料起始濃度對脫色率的影響

2.2.4 碳源和氮源。

該研究分別采用0、0.02%、0.10%、0.50%和1.00%的葡萄糖濃度和（NH4）2SO4濃度（培養(yǎng)液其他成分含量同脫色培養(yǎng)液），考察碳源和氮源含量對東方伊薩酵母菌YP1脫色的影響。

由圖6可知，在不添加葡萄糖條件下，24 h后東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR 脫色率很低，還不到17%。隨著葡萄糖濃度的增加，東方伊薩酵母菌YP1的脫色率增加。當(dāng)葡萄糖濃度增至1%時，脫色率達(dá)到最大，為99%。這說明要獲得理想的脫色效果需要提供碳源，東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR的脫色可能是共代謝作用的結(jié)果，而不能直接利用染料分子為碳源。同該菌株類似，陳曦等[8]報道，當(dāng)葡萄糖濃度從0.05%增至1.00%時，酵母菌Y48對活性黑KNB（100 mg/L）的脫色率從培養(yǎng)24 h的11% 增至100%。此外，東方伊薩酵母菌YP1未發(fā)生在葡萄糖過量時對染料的脫色效果的降低如沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）[9-10]的現(xiàn)象。

由圖6可知，當(dāng)（NH4）2SO4的濃度在0.02%～1.00%之間時，24 h后脫色率無顯著差異。在不加氮源（NH4）2SO4的情況下，

東方伊薩酵母菌

YP112 h 后脫色率就能達(dá)到95%。這可能是由于該酵母菌能夠利用染料分子為氮源。但是，當(dāng)?shù)礉舛仍黾訒r，染料的脫色速率得到明顯提高。這表明添加一定的氮源對東方伊薩酵母菌YP1脫色酶活性的啟動有幫助。該試驗中（NH4）2SO4濃度應(yīng)在0.1% 以上。有報道表明，對于有些微生物，增加氮源有利于提高染料廢水的脫色效果。Xu等[11]研究表明，撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerate） P2在以尿素為氮源降解甲基橙時，脫色率隨著尿素濃度的增加呈線性增加；也有研究表明，限氮能促進白腐真菌產(chǎn)酶，有利于穩(wěn)定關(guān)鍵酶的活性，并且發(fā)揮其對活性染料的脫色、降解功能[12-14]。

圖6 不同葡萄糖濃度和（NH4）2SO4濃度對脫色率的影響

2.2.5 脫色液動態(tài)掃描。

由圖7可知，50 mg/L酸性大紅GR脫色不同時段取樣，505 nm 處為酸性大紅GR的最大吸收峰。隨著菌株對染料的降解脫色，最大吸收峰a（0 h）、b（4 h）、c（8 h）、d（12 h）和f（36 h）依次降低，說明染料結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在4 h，東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR的脫色率為69.1%，12 h時染料則基本被降解。在36 h脫色過程中，未檢測到新的吸收峰出現(xiàn)，可能是東方伊薩酵母菌YP1將酸性大紅GR 分子徹底降解成水和二氧化碳，或轉(zhuǎn)化成其他微量小分子，而它們在該測量方法中未能被檢測到。

2.2.6 脫色酶的定位試驗。

由圖8可知，東方伊薩酵母菌YP1脫色后的上清液、粗酶液的上清液和對照組胞內(nèi)酶和胞外酶都對酸性大紅GR有脫色能力，但是效果差異明顯。脫色后上清液對染料脫色效果很差，對高濃度600 mg/L酸性大紅GR 24 h后脫色率僅4.51%。而東方伊薩酵母菌YP1粗酶液的上清液對高濃度600 mg/L酸性大紅GR脫色效率非常顯著，24 h即達(dá)到96%以上，且脫色速率很快。這說明東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR脫色起主要作用的脫色功能酶主要存在于細(xì)胞中，為胞內(nèi)酶。經(jīng)過破碎，完整細(xì)胞破壞，酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，很快與染料作用，使得脫色速度更快，效果更好。

通常來說，微生物對染料的脫色一般有吸附脫色和降解脫色2種機理。染料分子先吸附在菌體上，然后通過細(xì)胞酶的作用逐漸降解，其中吸附脫色機理主要是：構(gòu)成菌體表面的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)的一些集團通過化學(xué)鍵、離子鍵或氫鍵與染料作用，形成染料與大分子構(gòu)成的復(fù)合物，這些物質(zhì)通過分子間作用力進一步與其他染料分子進行作用，導(dǎo)致菌體對染料有較好的吸附[15]；而降解脫色機理主要是染料在菌體各種酶的作用下降解，主要是偶氮還原酶的還原脫色[16-17]。在不同濃度的染料脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的酶會發(fā)生不同程度的變化。

3 結(jié)論

（1）東方伊薩酵母菌YP1對酸性大紅GR脫色的優(yōu)化控制條件為：28 ℃為宜，最適pH 在4～8 之間，接種量應(yīng)不低于10%，（NH4）2SO4 濃度應(yīng)在0.1% 以上，葡萄糖濃度應(yīng)不低于1%。

（2）東方伊薩酵母菌YP1對不同濃度（50～800 mg/L）的酸性大紅GR具有不同程度的脫色效果。當(dāng)染料濃度小于200 mg/L時主要是生物降解脫色，濃度高于400 mg/L時脫色是由生物吸附和生物降解2種機制完成的。

（3）東方伊薩酵母菌YP1的胞內(nèi)酶對酸性大紅GR的降解脫色起主要的作用。

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