鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗的效果評價研究

孟 超，李寶臣，葉曼曼，周 飛，李肖梁，方維煥

(1.浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州310058;2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司;3.寧波大學(xué))

鴨傳染性漿膜炎，又稱鴨疫里默氏桿菌病，是由鴨疫里默氏桿菌(RA)引起，危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。1932年，美國學(xué)者Hendrickson 和Hilbert首次報道該病［1］，1936年，美國伊利諾斯州的一個商品鴨場發(fā)生該病，曾被稱為“鴨敗血癥”，Dougherty(1955)［2］等，經(jīng)全面病理學(xué)研究后，將該病命名為“傳染性漿膜炎”。Leibovitz(1972)［3］提議使用“鴨疫里默氏桿菌感染”名稱。

我國自1982年郭玉璞(1982)［4］等從北京郊區(qū)鴨場首次分離到鴨疫里默氏桿菌以來，所有養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎均有該病的發(fā)生，鴨、鵝及火雞等多種禽類易感，是一種接觸性傳染病，多呈急性或慢性敗血癥過程，以纖維素性肝周炎、心包炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為主要特征，傳播速度快，死亡率較高，對抗生素的耐藥性不斷增加，疫苗免疫是控制該病的有效方法之一。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鴨疫里氏桿菌血清1 型SG4 株和血清2 型ZZY7 株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗(1 型SG4 株+2 型ZZY7 株)由浙江某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，批次分別為201305、201306 和201307。

試驗動物為3日齡雛鴨，由紹興某種鴨場提供，品種為紹興麻鴨。

試驗在杭州某生物技術(shù)有限公司進行。

1.2 安全性檢驗 選取3日齡玻板凝集試驗為RA血清抗體陰性的雛鴨，免疫劑量為每羽0.25 mL 和0.5 mL，每一劑量組各免疫雛鴨30 羽，免疫途徑為頸部皮下注射。30 羽作為空白對照，相同條件下飼養(yǎng)觀察35 d。

每日觀察供試鴨精神、采食、糞便及臨床變化;每周分別撲殺5 羽，觀察接種部位的吸收情況及其他異常狀況。

1.3 攻毒效果試驗 主要通過免疫攻毒方法進行，每批次疫苗選取3日齡玻板凝集試驗為RA 血清抗體陰性的雛鴨50 羽，隨機分為5 組，每組10 羽。其中兩組為免疫組，免疫劑量為0.25 mL/羽;另兩組為未免疫攻毒對照組，第五組為不免疫和攻毒對照組。

免疫途徑為頸部皮下注射，動物隔離器內(nèi)飼養(yǎng)觀察21 d。免疫組與未免疫攻毒組分別使用血清1型SG4 株和血清2 型ZZY7 株強毒進行攻毒，腿部肌內(nèi)注射1.0 ×1010CFU 的鴨疫里氏桿菌SG4 或1.0 ×105CFU 鴨疫里氏桿菌ZZY7 株菌液。攻毒后7 d 內(nèi)觀察發(fā)病和死亡情況。

1.4 微量凝集抗體檢測試驗 將免疫后21 d 的供試鴨通過翅靜脈采血至1.5 mL 離心管內(nèi)，37℃溫箱中靜置1 h，然后8000 rpm 離心5 min，吸出析出血清，備用。將培養(yǎng)的鴨疫里默氏桿菌SG4 株和ZZY7 株菌液計數(shù)，然后用0.3%甲醛溶液滅活，再將滅活后的菌液5000 rpm 離心30 min。用生理鹽水離心洗滌3 次，最后一次菌懸液用生理鹽水調(diào)節(jié)至1.0 ×109CFU/mL，作為微量凝集抗體檢測試驗用抗原。

試驗步驟:將96 孔凝集板中加入50 μL 生理鹽水，再將第一孔加入50 μL 待檢血清，然后進行倍比稀釋，直至212 次方。

每個血清樣品兩次稀釋，分別加入SG4 株和ZZY7 株抗原50 μL，混勻后密封，室溫條件靜置24 h 后觀察沉淀狀況。

1.5 無菌檢驗 根據(jù)2010年版《中華人民共和國獸藥典》第三部所提供的方法進行檢驗。

將樣品量1 mL 接種含有50 mL 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h。然后將培養(yǎng)物移植至TG小管和GA 斜面(0.2 mL/支)，1 支在37℃培養(yǎng)，1支在25℃培養(yǎng)，另取1 支GP 0.2 mL/支，在25℃培養(yǎng)，觀察7 d，應(yīng)無菌生長。

1.6 劑型和黏度 劑型檢查主要確定劑型是油包水(O/W)或水包油(W/O)。方法是將疫苗乳劑先滴1 滴在水中，然后滴第2 滴，如果未出現(xiàn)擴散，其劑型則為油包水劑型，若第2 滴出現(xiàn)擴散則其劑型為水包油。

黏度檢測主要通過黏度計測定，其原理是將轉(zhuǎn)子浸入供試樣品溶液中，使轉(zhuǎn)子以一定的角速度旋轉(zhuǎn)，通過測量作用在轉(zhuǎn)子上的扭力矩，然后換算成黏度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性檢驗 詳見表1。

表1 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全檢驗結(jié)果

由表1可見，第5 周時，疫苗已基本吸收完全，僅殘留少量黃色干酪樣物。

2.2 體重變化 詳見表2。

表2 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全檢驗過程中的供試鴨體重變化

由表2可見，三批次疫苗免疫組鴨體重與未免疫組鴨體重未見明顯差異。

2.3 攻毒效果試驗 詳見表3。

表3 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗效力

由表3可見，血清1 型SG4 株為1 ×1010CFU/羽(復(fù)核后劑量為0.98 ×1010CFU/羽)，血清2 型ZZY7 株為1 ×105CFU/羽(復(fù)核后劑量為1.3 ×105CFU/羽)，腿部肌內(nèi)注射后觀察7 d，未免疫組鴨在攻毒后的死亡率達(dá)90%以上，免疫組所有供試鴨均未見死亡。

2.4 微量凝集抗體檢測結(jié)果 詳見表4。

表4 3 批次鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗免疫后凝集抗體檢測

由表4可見，免疫后21 d 血清凝集抗體檢測結(jié)果表明，SG4 株抗體效價均在7.7－8.5 log2 之間，顯著高于ZZY7 株抗體效價(3.0－3.4 log2)。三個批次疫苗間的抗體效價基本穩(wěn)定。

2.5 無菌檢驗 將三批疫苗進行無菌檢驗，菌檢結(jié)果均為陰性。

2.6 劑型、黏度和穩(wěn)定性檢驗 將疫苗1 滴滴于水中，然后滴第2 滴，呈圓形，均未出現(xiàn)擴散，說明該疫苗劑型屬油包水劑型(W/O)。

經(jīng)黏度計檢測三批疫苗的黏度值分別為48.5 cP、55.0 cP、53.5 cP。3000 rpm 離心15 min 后，劑型穩(wěn)定(不破乳)。

3 小結(jié)與討論

本試驗經(jīng)過全項檢驗，證明三個批次疫苗抗體效價基本穩(wěn)定，在使用安全性劑量免疫時，對3日齡雛鴨未見任何明顯影響，35 d 左右即可完全吸收，且經(jīng)過免疫后28 d 觀察，雛鴨體重增長情況處于正常水平。

馬遜(2010)［5］和王小蘭(2012)［6］等均將RA疫苗通過攻毒保護試驗得到良好保護，說明RA 有著良好的免疫原性。

本次攻毒效果試驗結(jié)果表明，鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗能夠較好保護鴨疫里默氏桿菌血清1型和血清2 型的強毒攻擊，抗體效價基本穩(wěn)定。無菌檢驗、黏度檢測、穩(wěn)定性和劑型檢測都處于良好水平。

綜合上述結(jié)果，表明浙江某生物技術(shù)有限公司試制的鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全、穩(wěn)定、有效，具有良好的推廣應(yīng)用價值。

［1］鄭龍光.鴨傳染性漿膜炎的研究進展［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012，6:57－58.

［2］Dougherty E，Saunders LZ，Parsons EH.The pathology of infectious serositis of ducks［J］.American Journal of Pathology，1955，31:475－487.

［3］Lebovitz L.A survey of the so-called ‘a(chǎn)natipestifer syndrome’［J］.Avian Diseases，1972，16:836－851.

［4］郭玉璞，陳德威，范國雄，等.北京鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1982，13(2):106－112.

［5］馬遜.鴨傳染性漿膜炎油乳劑滅活疫苗與不同佐劑二聯(lián)滅活疫苗的免疫原性比較研究［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010:18－23.

［6］王小蘭.鴨疫里默氏桿菌多價油乳劑滅活疫苗的研制［D］.上海:上海獸醫(yī)研所，2012:30－44.