比較MLPA與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在流產(chǎn)絨毛染色體分析中的應(yīng)用

王瑋 李海波 劉敏娟 段程穎 毛君 孫健 丁楊 陳瑛 李紅（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 生殖與遺傳中心，江蘇 蘇州 215002）

自然流產(chǎn)是孕早期最常見的并發(fā)癥[1]，約65%的受孕胚胎及15%的臨床可見妊娠會(huì)發(fā)生流產(chǎn)[2]，1%的女性會(huì)出現(xiàn)連續(xù)3次以上的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。而自然流產(chǎn)的病因通常不明或是多因素造成的，但約50%～70%的早期自然流產(chǎn)被認(rèn)為是染色體異常造成的，而這些異常中約95%表現(xiàn)為常染色體的非整倍體[3－5]，因此染色體倍性檢測(cè)是流產(chǎn)查因的重要方向。

細(xì)胞遺傳學(xué)是自然流產(chǎn)查因的首選技術(shù)手段，但其技術(shù)要求高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通量低，且存在10%～40%的樣本因培養(yǎng)失敗、細(xì)菌或真菌感染、母血污染等原因而未能給出檢測(cè)結(jié)果[6]。分子遺傳學(xué)技術(shù)如熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和定量熒光 PCR 技術(shù)（quantitative fluorescent-PCR，QF-PCR）等是檢測(cè)非整倍體的可靠方法，并能短時(shí)間內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)論，但這些技術(shù)檢測(cè)的染色體數(shù)目有限，且FISH、Array-CGH的檢測(cè)成本高昂。與之相比，多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）一次可實(shí)現(xiàn)基因組中40個(gè)目標(biāo)區(qū)的定量檢測(cè)，具有較高的性價(jià)比。2007年Diego-Alvarez等[7]即開始應(yīng)用MLPA技術(shù)對(duì)流產(chǎn)樣本檢測(cè)。本研究旨在對(duì)比MLPA與染色體核型分析在流產(chǎn)絨毛樣本中的檢測(cè)，明確兩種技術(shù)的效能，以期建立最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 簽署知情同意后，收集蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心2009年至2012年2月期間經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)胚胎停止發(fā)育后行清宮術(shù)的絨毛組織189份。孕婦平均年齡29歲，孕齡5～17周，為保護(hù)患者隱私，所有數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)分析均在未知患者臨床背景的狀態(tài)下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 于體視鏡下顯微操作挑取、分離絨毛樣本，明確為胎兒部分進(jìn)行清洗后用于細(xì)胞培養(yǎng)，傳統(tǒng)方法收獲和G顯帶體核型分析。

1.2.2 MLPA檢測(cè)分析 挑取流產(chǎn)絨毛約15 mg，采用Blood DNA mini Kit（QIAGEN 公司，德國(guó)）試劑盒提取基因組DNA。用ND-1000（Thromo公司，美國(guó)）測(cè)定DNA濃度和純度，并將DNA稀釋至25 ng/μl。依照 MLPA 試劑盒（SALSA P290-B1）的操作說(shuō)明操作，產(chǎn)物用ABI3130遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用Genemarker軟件分析電泳數(shù)據(jù)，并與細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果比對(duì)。

2 結(jié) 果

189例絨毛樣本經(jīng)細(xì)胞遺傳和MLPA同步分析兩種方法綜合分析成功187例，占98.94%，因質(zhì)量問題2例樣本用兩種方法均未能給出檢測(cè)結(jié)論。

其中核型分析成功117例，占61.90%，72例因培養(yǎng)失敗等因素未能成功核型分析，占38.10%；185例有MLPA檢測(cè)結(jié)論，占97.88%，4例樣本未見探針信號(hào)或雜亂而無(wú)法分析。MLPA與核型分析結(jié)論一致70例，占37.03%。42例多倍體或非探針目標(biāo)區(qū)染色體異常，MLPA未能檢出，占其獨(dú)立檢測(cè)樣本的22.70%（42/185），則獨(dú)立應(yīng)用 MLPA可成功分析143例，占總樣本的75.66%。兩種技術(shù)方法檢測(cè)效能的對(duì)比分析參考（表1）。

2.1 MLPA結(jié)果與核型結(jié)論一致 70例樣本兩種技術(shù)結(jié)論一致。其中43例（22.99%）未見明顯異常，27例（14.44%）可見部分染色體的非整倍體。

2.2 兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)論不一致 3例樣本（1.60%）經(jīng)MLPA兩次雙盲實(shí)驗(yàn)明確為微缺失/微重復(fù)綜合征而核型分析未能檢出。包括7q11.23區(qū)域與 William-Beuren綜合征 （OMIM：609757）相關(guān)的微重復(fù) 1例；15q11.2區(qū)域與 Prader-Willi/Angelman綜合（OMIM：176270/105830）征相關(guān)的微重復(fù)1例；22q13.33區(qū)域與22q13/Phelan-McDermid綜合征（OMIM：606232）相關(guān)的微缺失1例。42例樣本（22.22%）因多倍體或非探針目標(biāo)區(qū)染色體異常，MLPA未能檢出，包括非探針目標(biāo)區(qū)的非整倍體21例（11.23%），多倍體7例（3.74%），嵌合體14例（7.49%）

2.3 只有一種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)論 共70例樣本（37.03%）因污染、培養(yǎng)失敗等原因僅能通過(guò) MLPA得出檢測(cè)結(jié)論，包括35例（18.72%）未見明顯異常，26例（13.90%）存在非整倍體，9例（4.81%）存在非同一條染色體的單個(gè)或多個(gè)探針的異常（信號(hào)降低3例，信號(hào)增加6例），懷疑為微缺失或微重復(fù)。2例（1.07%）可能因樣本質(zhì)量、核酸降解或污染等原因，MLPA未能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，僅有核型分析結(jié)果[1例為45，XO；1例為92，XXYY，t（8；14）]。

表1 MLPA與染色體核型檢測(cè)的對(duì)照分析

3 討 論

胚胎染色體異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要原因之一，早期自然流產(chǎn)的胚胎染色體異常以染色體多倍體和非整倍體異常為主，最常見的是染色體數(shù)目異常，而結(jié)構(gòu)異常所占比例較少[8]，這在本研究中也得到了驗(yàn)證。目前，最常用的檢測(cè)方法主要是通過(guò)絨毛活檢取胎兒細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。但該方法存在時(shí)間長(zhǎng)、易污染、對(duì)操作人員要求高等缺陷，有著一定的局限性。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，這些問題得到了逐步解決。MLPA技術(shù)是2002年荷蘭科學(xué)家Schouten等[9]發(fā)明的一種針對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性和定量分析技術(shù)，從DNA提取至結(jié)果分析僅需l～2個(gè)工作日，每次反應(yīng)可同時(shí)對(duì)多達(dá)30～50目標(biāo)位點(diǎn)的缺失、重復(fù)、單核苷酸多態(tài)性等進(jìn)行檢測(cè)，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單，設(shè)備自動(dòng)化程度高，具有快速、高通量的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)檢測(cè)幾十個(gè)樣本。

目前國(guó)內(nèi)已有采用MLPA（SALSA P095）僅針對(duì)流產(chǎn)絨毛13、18、21、X和Y非整倍體檢測(cè)的報(bào)道[10]，目前MLPA針對(duì)染色體組拷貝數(shù)異常檢測(cè)的試劑盒有多個(gè)，包括多個(gè)針對(duì)微缺失/微重復(fù)、染色體端粒、5條常見非整倍體、具體染色體長(zhǎng)短臂及組合型的檢測(cè)試劑盒。而流產(chǎn)絨毛樣本不僅僅是常見5條染色體的數(shù)目異常，還包括其他染色體數(shù)目異常[11]，及染色體的微缺失[12，13]等。考慮盡可能覆蓋與已知流產(chǎn)密切相關(guān)的染色體畸變，組合型試劑盒SALSA P290-B1成為本次研究的選擇對(duì)象，其除了能檢查常見的13、18、21、X和Y 5條常見染色體非整倍體情況，同時(shí)可對(duì)常見14種染色體微缺失/微重復(fù)情況進(jìn)行檢測(cè)。共包含13條染色體上的51個(gè)探針：除21號(hào)染色體6個(gè)探針，13號(hào)、18號(hào)、X染色體各4個(gè)探針，Y染色體2個(gè)探針之外，還包括17號(hào)染色體8個(gè)探針，15號(hào)染色體6個(gè)探針，22號(hào)染色體5個(gè)探針，1號(hào)、7號(hào)染色體各3個(gè)探針，4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)染色體各2個(gè)探針，不包含12號(hào)、14號(hào)、16號(hào)等其他10條染色體信息。較之Caramins MC等[14]采用SALSA P070的全染色體端粒探針，本研究在常見非整倍體及微缺失/微重復(fù)綜合征檢測(cè)的探針密度增加，并發(fā)現(xiàn)3例核型分析未見的可能與流產(chǎn)相關(guān)的微缺失/微重復(fù)。但75.66%的綜合檢出效能較之 Caramins MC等[14]采用SALSA P070 85.91%的檢出效能有所降低，可見SALSA P290-B1探針試劑盒中未包含的10條染色體約占流產(chǎn)異常染色體的10%，流產(chǎn)絨毛中染色體數(shù)目異常較之微缺失/微重復(fù)等亞顯微結(jié)構(gòu)異常占有更多比例。

本研究189例流產(chǎn)絨毛樣本，細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)共檢出異常71例，正常43例，未能正確檢出3例，培養(yǎng)失敗72例。MLPA技術(shù)共檢出異常65例，正常78例，未能正確檢出42例，無(wú)結(jié)果4例（表1）。兩者比較 MLPA能增加30.69%明確檢出率（58/189），這部分增加的檢出率主要是針對(duì)培養(yǎng)失敗的樣本，進(jìn)一步分析這些數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，成功檢出的樣本中MLPA的正常檢出率（54.54%）要顯著高于核型分析（37.72%）（P＜0.05），而異常檢出率核型分析（62.28%）顯著高于 MLPA（45.45%）（P＜0.05）。且獨(dú)立采用MLPA的檢出效能（75.66%）和獨(dú)立采用核型分析的檢出效能（60.32%）均不能完全滿足臨床需求，因此兩者各有技術(shù)優(yōu)劣。核型分析的缺陷主要表現(xiàn)為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、培養(yǎng)失敗、染色體形態(tài)難分辨等；而MLPA的缺陷主要因其技術(shù)限制，包括染色體平衡易位、多倍體、非探針目標(biāo)區(qū)的染色體劑量異常等。因此最佳的實(shí)驗(yàn)室方案應(yīng)該是MLPA與核型分析同步雙盲對(duì)流產(chǎn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，這樣可達(dá)到98.94%的檢測(cè)成功率。考慮到檢測(cè)成本和性價(jià)比，根據(jù)我們對(duì)兩者檢測(cè)效能的分析，先行MLPA檢測(cè)，核型分析作為補(bǔ)充是最佳的實(shí)驗(yàn)室方案。但因MLPA實(shí)驗(yàn)過(guò)程至少需要2個(gè)工作日，如果未能給出檢測(cè)結(jié)論，凍存后的絨毛樣本再培養(yǎng)制備染色體會(huì)因部分絨毛細(xì)胞死亡而相對(duì)困難，而凍存的絨毛樣本并不影響后續(xù)的DNA提取。因此，綜合考慮檢測(cè)成本和效能，先行染色體核型分析并同時(shí)留取流產(chǎn)絨毛樣本，應(yīng)用MLPA作為核型分析失敗的補(bǔ)充方案具有臨床可行性。

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