新型固定化乙酰膽堿酯酶傳感器的制備及氨基甲酸酯農(nóng)殘檢測

伍周玲，梁東軍，郭 明，王曉萌，范文翔

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.浙江農(nóng)林大學 理學院，浙江 臨安 311300）

氨基甲酸酯類殺蟲劑殺蟲活性高，在工農(nóng)業(yè)中被廣泛應用，由此帶來的農(nóng)殘問題已成為影響人類健康與環(huán)境安全的重大隱患。目前，常用于農(nóng)殘檢測的手段主要有液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜、薄層色譜和氣質(zhì)聯(lián)用等方法[1－5]。這些方法預處理繁瑣[2－6]，檢測周期長，儀器昂貴，尚不能滿足現(xiàn)場檢測的要求，因此，建立快速可靠靈敏的新型分析方法日益重要，電化學生物傳感器由于在農(nóng)殘檢測中具有諸多優(yōu)點，已成為農(nóng)殘檢測分析領(lǐng)域的研究熱點[7－10]，其基本原理是傳感器上的酶與底物相互作用后，生成具有電化學活性的物質(zhì)，產(chǎn)生氧化還原峰，當酶受到農(nóng)藥抑制時，峰電流會相應減少[11]，進而通過峰電流的降低值來判斷農(nóng)藥對酶的抑制程度，完成農(nóng)藥的定量檢測[12]。多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，CNTs）因它在酶活性中心和電極表面的高速電子轉(zhuǎn)移能力而被用于酶生物傳感器中電子轉(zhuǎn)移的 “導線”，該類生物傳感器已被廣泛報道[13－14]。多壁碳納米管在溶液中極易發(fā)生團聚[15]，而將多壁碳納米管用強氧化劑進行功能化處理，能夠有效地阻止多壁碳納米管發(fā)生團聚，使多壁碳納米管很好地分散在溶液中，形成均一、穩(wěn)定的分散液[12，14]，將其用于修飾電極，預期可以制備多用途的生物傳感器[17]。在電化學生物傳感器的構(gòu)建過程中，酶在電極上的固定是關(guān)鍵。目前，使用的方法有吸附法、包埋法、共價鍵合法、交聯(lián)法、溶膠-凝膠法及電聚合法等[18－20]，這些方法將酶直接修飾于電極表面，酶層容易脫落，傳感器穩(wěn)定性差。雙醛纖維素（dialdehyde cellulose，DAC）作為纖維素的衍生物之一，其分子結(jié)構(gòu)上的羥基容易與極性官能基團形成氫鍵，使其具有較強的吸附能力，同時其分子結(jié)構(gòu)中的醛基可以與酶分子中的氨基通過共價鍵聯(lián)生成Schiff堿化合物[21－22]，能使酶穩(wěn)定地固定于載體上，是一種極具前景的固定化酶載體材料。本研究將新型材料與新型方法結(jié)合，將游離酶通過化學鍵聯(lián)技術(shù)固定在載體上制成固定化酶，再通過自組裝法制備多層殼聚糖/固定化乙酰膽堿酯酶/功能化碳納米管電化學生物傳感器（Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE）。與現(xiàn)有常規(guī)方法相比，該方法吸附酶量大，酶層不易脫落，傳感器性能穩(wěn)定，線性范圍寬，靈敏度高，可為氨基甲酸酯類殺蟲劑檢測提供快速靈敏的方法，具有一定的新意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站（上海辰華儀器有限公司，中國）；三電極系統(tǒng)：修飾的CHI104玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE，直徑3 mm）作為工作電極，飽和甘汞電極（saturated calomel electrode，SCE）作為參比電極，鉑電極作為對電極；SK3210HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司，中國）；電子分析天平（Sartorius公司，德國）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華儀器設(shè)備有限公司，中國）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，中國）。

雙醛纖維素（DAC，水熱合成法合成）；1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯（CAB，純度＞99.6%，上海市農(nóng)藥研究所），乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE，220 mol·s－1·g－1，上海源葉生物科技有限公司），碘化乙酰硫代膽堿（acetylthiocholine iodid，ATCh，純度＞98%，阿拉丁公司）；多壁碳納米管（CNTs，純度＞95%，中國科學院成都化學有限公司）；殼聚糖（Chi，脫乙酰度≥90%，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為雙蒸蒸餾水。

1.2 多壁碳納米管的功能化

取10.0 mg多壁碳納米管置于50.0 mL濃鹽酸中，磁力攪拌下加熱回流7.0 h，以去除金屬催化劑。純化后的多壁碳納米管置于80.0 mL酸液[V（硝酸）∶V（硫酸）=1∶3]中，室溫下超聲反應10.0 h。蒸餾水洗至中性，得到羧基化的多壁碳納米管（functional carbon nanotubes,F-CNTs）[12]，干燥成粉末，取10.0 mg羧基化的多壁碳納米管溶于N,N-二甲基甲酰胺中，超聲20 min使其分散均勻備用。

1.3 固載酶的制備

磷酸鹽緩沖液中，28℃溫度下雙醛纖維素與乙酰膽堿酯酶磁力攪拌反應2.5 h后取出分離，蒸餾水洗滌至無游離酶，抽濾干燥，制成固定化乙酰膽堿酯酶懸濁液（DAC-AChE），4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AChE傳感器的制備及表征

玻碳電極分別用0.30和0.05 μm的氧化鋁粉末在拋光布上進行拋光，大量二次蒸餾水沖洗，后將玻碳電極移入超聲清洗儀中依次用二次蒸餾水、無水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗（5 min·次－1），室溫晾干。取5.0 μL羧基化的多壁碳納米管（F-CNTs）溶液滴涂至預處理好的玻碳電極表面，晾干后再滴涂5.0 μL固定化乙酰膽堿酯酶（DAC-AChE），自然干燥，最后滴涂5.0 μL殼聚糖溶液（Chi，5.0 g·L－1），制成Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器，4℃冰箱中保存。同條件下制備Chi/DAC-AChE/GCE，Chi/DAC/FCNTs/GCE修飾電極。

采用傳統(tǒng)三電極體系，以 5.0 mmol·L－1[Fe（CN）6]4－/3－為氧化還原探針，以修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為輔助電極，于0.l mol·L－1氯化鉀電解質(zhì)溶液中，進行電化學阻抗表征。

1.5 氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測

傳感器浸入0.2 mmol·L－1碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中進行差分脈沖伏安掃描，記錄未受氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制的傳感器的峰電流I0；然后將該傳感器侵入含不同濃度氨基甲酸酯類殺蟲劑的磷酸鹽緩沖溶液中抑制14 min，洗凈后于0.2 mmol·L－1碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中進行差分脈沖伏安掃描，檢測受氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制后的傳感器的峰電流I1，按公式（1）計算氨基甲酸酯類殺蟲劑對該傳感器中酶的抑制率I（%）。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的交流阻抗表征

利用交流阻抗對傳感器進行表征，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：裸電極（a）的界面電子傳遞阻力很大，將羧基化的多壁碳納米管和雙醛纖維素修飾到電極表面（b），阻抗值明顯減少。這是因為功能化的碳納米管極易被溶劑潤濕，能形成較好的電極/溶液界面，加速電子傳遞。而當固定化乙酰膽堿酯酶固定到電極表面（c），阻抗值增加。這是因為乙酰膽堿酯酶的加入，一方面增大了[Fe（CN）6]4－/3－通過膜時的阻力，另一方面使[Fe（CN）6]4－/3－向電極表面擴散的有效截面積也進一步變小，從而導致阻抗值增大，這也說明固定化酶制備成功，且已修飾到電極表面。加Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 電極（c）與 Chi/DAC-AChE/GCE 電極（d）相比，阻抗值小很多，這是由于羧基化的多壁碳納米管表面帶有大量的羧基，不僅改進了多碳納米管的分散性，而且能加速氧化還原物質(zhì)與電極間的電子轉(zhuǎn)移。

圖 1 不同電極在含[Fe（CN）6]4－/3－-氯化鉀溶液中的交流阻抗譜Figure1 Electrochemical impedance spectra of different modified electrodes measured in [Fe（CN）6]4－/3-solution

2.2 Chi/DAC-AChE/GCE的循環(huán)伏安特性

圖 2A 為 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 電極在 5.0 mmol·L－1鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]-0.1 mol·L－1氯化鉀溶液中不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖，圖2B為峰電流與掃速平方根的線性關(guān)系圖。由圖2可知，在鐵氰化鉀-氯化鉀溶液中隨著掃描速率的增加，電極的還原峰電流和氧化峰電流與掃描速率平方根呈線性關(guān)系，線性回歸方程列于表1。圖2結(jié)合表1可知：隨著掃速（v）的增加，峰電流（I）亦相應增加，峰電流與掃描速率平方根呈良好的線性關(guān)系，說明該電極反應過程受擴散控制。

裸GCE，Chi/DAC/F-CNTs/GCE，Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE和Chi/DAC-AChE/GCE的循環(huán)伏安曲線如圖3所示。由圖3可知：在pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液中，Chi/DAC/F-CNTs/GCE修飾電極（a），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（b）和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極（c）均未觀察到峰出現(xiàn)，說明底物碘化乙酰硫代膽堿不存在時，未見明顯的氧化還原反應。當加入碘化乙酰硫代膽堿后，裸GCE電極（d）和Chi/DAC/F-CNTs/GCE修飾電極（e）上仍沒有峰出現(xiàn)，說明羧基化的多壁碳納米管和雙醛纖維素在該電勢范圍無活性，而Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（f）和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極（g）都出現(xiàn)不可逆氧化峰，此氧化峰是由于乙酰膽堿酯酶催化碘化乙酰硫代膽堿水解生成電活性物質(zhì)硫代膽堿，硫代膽堿中的巰基被氧化所產(chǎn)生的，且Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（f）的峰電流明顯比Chi/DACAChE/GCE修飾電極（g）的大，說明羧基化的多壁碳納米管有助于氧化還原物質(zhì)與電極間的電子轉(zhuǎn)移，電極靈敏度增強。將Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極在殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯中抑制后，再于碘化乙酰硫代膽堿-磷酸鹽緩沖溶液中測試循環(huán)伏安曲線（k和h），結(jié)果顯示硫代膽堿的氧化電流下降，說明1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯抑制了電極上乙酰膽堿酯酶的活性。利用硫代膽堿氧化產(chǎn)生的電流變化情況可定量分析乙酰膽堿酯酶的活性，表征氨基甲酸酯類殺蟲劑在抑制反應中的作用，通過抑制率可定量檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑含量。

圖2 傳感器在不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖（A）和峰電流與掃速平方根的關(guān)系圖（B）Figure2 Cyclic voltammograms of sensor at different scan rates（A） and the dependence of peak currents vs.v1/2（B）

表1 掃速對峰電流影響數(shù)據(jù)的擬合方程Table1 Equation of the effect of scan rate on the peak current

圖 4（A）為 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 傳感器對碘化硫代乙酰膽堿的差分脈沖伏安圖，顯示了傳感器對不同濃度碘化乙酰硫代膽堿檢測的響應性。從圖4（A）可以看出：隨著濃度的增加，電流亦增加，表明乙酰膽堿酯酶已經(jīng)成功修飾到電極上，且能催化溶液中的碘化乙酰硫代膽堿發(fā)生水解。

提取圖4（A）中峰電流，考察峰電流與碘化乙酰硫代膽堿濃度的關(guān)系，結(jié)果表明：峰電流（I）與碘化乙酰硫代膽堿濃度（c）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)方程為：I=－6.7579c－4.1380（R=0.9958,S=0.0738,N=7,P＜0.01），詳見圖 4（B）。

圖 3 Chi/DAC/F-CNTs/GCE （ a，e），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE（b，f，k），Chi/DAC-AChE/GCE（c，g，h），裸 GCE（d）在碘化乙酰硫代膽堿-磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安曲線Figure3 Cyclic voltammograms of the Chi/DAC/F-CNTs/GCE（a,e），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE（b，f，k），Chi/DACAChE/GCE（c，g，h），bare GCE（d） in ATCh-PBS

2.3 傳感器性能參數(shù)的優(yōu)化

基于農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的抑制作用制備傳感器用于農(nóng)藥的檢測，傳感器的性能主要受電解質(zhì)溶液pH值和傳感器在農(nóng)藥中的抑制時間的影響，為此，本研究主要考察了電解質(zhì)溶液的pH值和傳感器在氨基甲酸類殺蟲劑中的抑制時間對峰電流的影響，結(jié)果如圖5所示。對測定數(shù)據(jù)進行非線性擬合，獲得理論方程如表2所示。

圖4 傳感器對碘化乙酰硫代膽堿的差分脈沖伏安圖（A）和峰電流與碘化乙酰硫代膽堿濃度的關(guān)系圖（B）Figure4 Differential pulse voltammetry of ATCh （A） and relationships between peak current and ATCh concentration （B）

從圖5A可知：當磷酸鹽緩沖溶液pH 6.6時，測得的峰電流最大，說明電解質(zhì)的pH 6.6時更易保持酶的活性，所以本實驗選擇 pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液作為底液。由圖5B可知：在1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯溶液中隨著時間的延長，Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE電極在碘化乙酰硫代膽堿中的峰電流明顯降低，1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制作用加強，酶活性在抑制作用的前14 min內(nèi)迅速減小，當抑制時間超過14 min，乙酰膽堿酯酶的抑制率趨于穩(wěn)定,表明1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯與乙酰膽堿酯酶中有效基團的結(jié)合作用已到達飽和狀態(tài)，因此，在1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的測定過程中，抑制時間選擇為14 min。

圖 5 pH值對Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE的影響（A）和抑制時間與酶抑制率的關(guān)系曲線（B）Figure5 Effect of pH on Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE and relationships between inhibiting time and inhibition rate （B）

2.4 傳感器對氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測性能

將Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器分別浸泡在不同濃度的殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯標準品中抑制后，測試碘化乙酰硫代膽堿在傳感器上的氧化峰電流，結(jié)果如圖6所示。隨著殺蟲劑質(zhì)量濃度的增大，峰電流逐漸減小，電流的衰減與殺蟲劑的濃度存在一定的關(guān)系。以1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制率對1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的質(zhì)量濃度作圖，如圖6所示，可分為2個線性段：1.5～6.0 μg·L-1和 6.0～16.0 μg·L-1。線性回歸方程列于表 3。按抑制率為 10%時為氨基甲酸酯類殺蟲劑的最低檢出限，得到該傳感器的檢出限為3.5 μg·L-1，傳感器的靈敏度為3.7～5.1 μg·L-1。

2.5 樣品回收率測定

利用1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯標準品，配制10.0 μg·L-1溶液，采用標準加入法測定樣品回收率，結(jié)果如表4所示。5次平行測定的回收率為97.89%，說明該生物傳感器用于實際樣品的檢測結(jié)果是比較準確的。

表2 pH和抑制時間對傳感器影響數(shù)據(jù)的擬合方程Table2 Equation of the effect of pH and inhibiting time on the sensor

表3 1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯濃度對酶抑制率影響數(shù)據(jù)的擬合方程Table3 Equation of the effect of CAB concentration on the inhibition rate

表4 傳感器對1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的回收率測定Table4 Recoveries of the sensor for CAB

2.6 電極的重復性、穩(wěn)定性及再生

同一支傳感器在含1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中抑制14 min后，放入含碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液中平行測定10次，峰電流值的相對標準偏差為1.57%，說明該電極的重復性較好。

將傳感器浸泡于磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中4℃冰箱保存，10 d后，該傳感器的峰電流無明顯降低，1個月后再次測量，響應電流仍能保持初始響應電流的85.0%，說明此法制備的傳感器壽命長且穩(wěn)定性較好，為酶提供了良好的生物相容性。

圖6 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE在不同濃度1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯中的微分脈沖伏安圖（A）和酶抑制率與1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯濃度的關(guān)系圖（B）Figure6 Differential pulse voltammograms of Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE for different concentration CAB （A）and relationships between inhibition rate and CAB concentration （B）

氨基甲酸酯類殺蟲劑對乙酰膽堿酯酶的強抑制性限制了該類傳感器的重復利用。參照文獻方法[23]將酶電極浸泡在磷酸鹽緩沖溶液中去除部分失活的酶，實現(xiàn)酶片的重復利用。4℃冰箱中，將酶電極在0.1 mol·L－1pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡3 d，其峰電流值能夠恢復到原來的 93.5%，與文獻相比[24]，此法簡捷可靠。

2.7 討論

氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制乙酰膽堿酯酶活性的機制是：氨基甲酸酯類殺蟲劑進入人體后，抑制乙酰膽堿酯酶活性使酶活性中心絲氨酸的羥基被氨基甲?；蚨ッ笇σ阴Ｄ憠A的水解能力，以致體內(nèi)乙酰膽堿大量蓄積，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)及膽堿能神經(jīng)過度興奮，最后轉(zhuǎn)入抑制和衰竭，引發(fā)一系列疾病[25]。有機磷類殺蟲劑進入人體后，其磷酰基會與乙酰膽堿酯酶的活性部分緊密結(jié)合形成磷?；憠A酯酶，同樣可使乙酰膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的能力，因此，本研究提供的傳感器不但可用于氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測，還可用于有機磷類殺蟲劑的檢測，可以說是有機磷類殺蟲劑檢測的一種新方法。

3 結(jié)論

本研究通過化學鍵聯(lián)技術(shù)將游離酶固定化后修飾到玻碳電極，成功制得了Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器，利用酶抑制原理建立了檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑的方法。該傳感器對典型氨基甲酸酯類殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的檢出限可達3.5 μg·L－1。該法與目前直接用游離酶修飾的酶電極方法不同，此法是以固定化酶的形式間接修飾在電極上，制備簡單，方法新穎，不但能較好地保持酶的活性，而且能增強酶在電極表面的穩(wěn)定性，同時利用羧基化的多壁碳納米管的多孔性，大比表面積，來增強電子傳遞。由于其他氨基甲酸酯類殺蟲劑與1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制原理相同，因此，此傳感器同樣適用于其他的氨基甲酸酯類殺蟲劑，在檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑殘留的應用中具有廣闊的前景。

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