CaMV35S啟動子驅(qū)動的FT基因調(diào)控楊樹早期開花的初步研究

賈小明，張煥玲

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院 西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

FT（Flowering Locus T）基因是模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana的重要開花調(diào)控因子之一，其編碼蛋白質(zhì)是可以長距離轉(zhuǎn)運成花激素的主要成分，在花形成過程中起關(guān)鍵作用[1-2]。目前，已經(jīng)在水稻Oryza sativa[3]，小麥 Triticum sestivum[4]，葫蘆 Cucurbita moschata[5]，番茄 Lycopersicon esculentum[6]，柑橘 Poncirus trifoliate[7]，蘋果 Malus × domestica[8]，楊樹 Populus[1,9-12]等中克隆出 FT 的同源基因，并對部分植物進行了遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植物中FT類基因的過量表達均不同程度地引起了轉(zhuǎn)基因植株的早期開花。水稻FT同源基因Hd3a在水稻中的過量表達，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化株具有不依賴于光周期的極早花表型[3]。多年三葉桔Poncirus trifoliata FT同源基因CiFT的組成型表達，促使幼齡期植株提早進入生殖階段[7]。蘋果FT同源基因MdFT1在蘋果和楊樹中的組成型、或在擬南芥韌皮篩管特異表達啟動子SUC2作用下的特異表達，均可有效促進轉(zhuǎn)化株的開花，開花促進作用甚至表現(xiàn)在組織培養(yǎng)階段[8]。楊樹中，Hsu等[9]在美洲黑楊Populus deltoides中克隆到了與其開花誘導(dǎo)或季節(jié)性生長等相關(guān)的基因 FT2，并將 FT2轉(zhuǎn)入楊樹幼樹中，使它們 1 a內(nèi)開花。B?hlenius等[1]將毛果楊P.trichocarpa的FT同源基因 FT1轉(zhuǎn)入雜種楊中，4周后農(nóng)桿菌Agrobacterium浸染的莖段即出現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)T1表達量稍弱的植株6個月可以成花。Shen等[12]克隆了小葉楊Populus simonii的2個FT同源基因PsFT1和PsFT2，轉(zhuǎn)基因楊樹在40 d內(nèi)即可開花。FT基因在木本植物中應(yīng)用的關(guān)鍵是其誘導(dǎo)的花能夠產(chǎn)生有育性的正常配子。上述研究結(jié)果均只顯示了FT基因能夠促進轉(zhuǎn)基因植物提前開花，重點在開花過程中FT基因轉(zhuǎn)錄、表達活性及與其他基因的抑制/促進關(guān)系研究方面，而對于其誘導(dǎo)的花的發(fā)育及花器官的變異卻很少涉及。我們曾對熱激啟動子（HSP）驅(qū)動的不同種類 FT基因誘導(dǎo)的楊樹花器官進行較為詳細(xì)的報道[13]，發(fā)現(xiàn)HSP驅(qū)動的FT基因誘導(dǎo)的楊樹花器官變異較大，有單性單朵花，兩性單朵花，正常的柔荑花序，以及回復(fù)營養(yǎng)生長的花序等。那么，作為植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最為普遍的組成型啟動子——CaMV35S啟動子，其驅(qū)動的FT基因誘導(dǎo)的楊樹花器官變異有多大，同HSP啟動子相比較，變異程度如何，都值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 35S::FT表達載體構(gòu)建

從擬南芥中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增獲得FT基因編碼區(qū)，利用Gateway技術(shù)將擴增片段克隆在雙元表達載體pH35GS（Invitrogen）上，代替位于CaMV35S啟動子下游的ccdB基因。擴增引物為：5′-GGCATCGTATCAAGCTTACTAGTG-3′，5′-ATCAAGAACGTCTCCAACAACTCTG-3′。

1.2 植物材料、轉(zhuǎn)化及植株再生

供試楊樹為雜種無性系T89（雄株，P.tremula×P.tremuloides）及無性系717（雌株，P.tremula×P.alba）試管苗。35S::FT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（LBA4404）參考Holstein等[14]的方法，無性系T89和717再生、轉(zhuǎn)化參照Tuominen等[15]的方法。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測參照Filichkin等[16]的方法，擴增引物為：5′-AGTGAAGGCATCGTATCAAGC-3′，5′-CGCGGGATATCACCACTTTG-3′。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)及開花觀察

將 PCR 檢測呈陽性的植株按株系編號，于（25+2）℃，光照 16 h·d-1，光強 45 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中莖段擴繁培養(yǎng)，待不定芽長至2 cm時生根培養(yǎng)，期間觀察記錄在試管培養(yǎng)階段的開花情況。將試管培養(yǎng)階段形成初始花結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株一部分莖段擴繁繼代，觀察35S::FT在繼代過程中的誘導(dǎo)開花情況；同時，將形成初始花結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株另一部分移栽至裝有滅菌移栽基質(zhì)的塑料容器中（口徑5 cm），澆水后放在裝水的密封塑料袋內(nèi)煉苗3周后移至溫室[溫度（25±2）℃，光照時間16 h·d-1，光照強度120 μmol·m-2·s-1]培養(yǎng)；待苗高長至15 cm時移栽至口徑20 cm的大塑料容器中，觀察記錄溫室培養(yǎng)階段的開花情況。澆水 1 次·d-1，施液體肥料 1 次·周-1[V（氮）∶V（磷）∶V（鉀）=20∶20∶20]。最后，將溫室培養(yǎng)開花的轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)至露天栽培，經(jīng)過1個冬季休眠后，于生長季觀察轉(zhuǎn)基因植株的2次開花能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 35S::FT轉(zhuǎn)基因植株的獲得及開花率

試驗總共獲得無性系T89轉(zhuǎn)基因陽性株系15個，其中在6個轉(zhuǎn)基因株系中觀察到了早期開花現(xiàn)象，開花株系占陽性株系的40.0%。獲得無性系717轉(zhuǎn)基因陽性株系11個，其中在5個轉(zhuǎn)基因株系中觀察到了早期開花現(xiàn)象，開花株系占陽性株系的45.5%。同我們之前在HSP::FT中的研究結(jié)果類似[11,13]，2種楊樹同一開花轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)，并不是所有單株都能誘導(dǎo)開花，開花率（開花株系內(nèi)，開花個體占總個體數(shù)的百分率）最高的株系約為56.0%，最低的約為12.0%，這種現(xiàn)象在楊樹開花基因轉(zhuǎn)化研究中很常見，可能是由于FT基因插入楊樹基因組的不同位點影響的結(jié)果，例如插入位點位于正向調(diào)節(jié)元件周圍，或位于反向調(diào)節(jié)元件周圍，會導(dǎo)致FT基因不同地表達強度和特異性?；蛘卟迦氘惾旧|(zhì)區(qū)，而非常染色質(zhì)區(qū)域時，由于與周邊序列堿基組成的差異，都可以引起基因沉默，從而失去表達的能力[17]。

2.2 35S::FT轉(zhuǎn)基因植株分生組織屬性轉(zhuǎn)變及初始花結(jié)構(gòu)的形成發(fā)生于試管培養(yǎng)階段

轉(zhuǎn)基因植株頂端分生組織屬性的轉(zhuǎn)變及初始花結(jié)構(gòu)的形成發(fā)生于試管培養(yǎng)階段，試管培養(yǎng)2個月，株高為4～6 cm的植株就可開始初始花結(jié)構(gòu)的發(fā)育（圖1a），說明轉(zhuǎn)基因植株頂端分生組織屬性的改變最早可發(fā)生于外植體與農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens共培養(yǎng)之后至不定芽誘導(dǎo)出的2個月內(nèi)。

在該時段內(nèi)，頂端分生組織由營養(yǎng)型向生殖型轉(zhuǎn)變，變成花序型分生組織[18]，花序型分生組織在發(fā)育過程中，一部分在葉腋部位產(chǎn)生花芽，一部分繼續(xù)生長、伸長，在新的葉腋部位產(chǎn)生更多的花芽。花芽發(fā)育時，最開始從葉腋部位長出一細(xì)絲狀類似于花梗的結(jié)構(gòu)，隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)絲結(jié)構(gòu)會伸長，約2周后，長至3～5 mm時，其頂端會慢慢膨大，在隨后的溫室培養(yǎng)中會分化成花器官，形成單朵花（圖1b）。

花是極度壓縮的枝條，楊樹野生型花是由很多小花緊密著生在花軸上，形成一柔荑花序，各小花之間無節(jié)間。而轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的這些單朵花更像著生在一花枝上面，每朵花基部有一葉片，2朵花之間的節(jié)間較長，約5 mm。這似乎暗示了35S::FT基因可能只決定了開花的時間，不能使頂端分生組織屬性由營養(yǎng)型向生殖型徹底轉(zhuǎn)變，一部分營養(yǎng)生長還在繼續(xù)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生4～6朵單朵花時，花序型分生組織營養(yǎng)生長才明顯受到抑制，產(chǎn)生于頂端的8～10朵花簇生在一起，外觀更像一花序，花與花之間的節(jié)間極度縮短，基部沒有葉片，頂端成花，不再伸長生長（圖1c）。

2.3 35S::FT轉(zhuǎn)基因開花株系開花率隨繼代次數(shù)增加而降低，兩性花比例上升

試驗發(fā)現(xiàn)，開花的轉(zhuǎn)基因株系繼代后開花率大幅下降（表1）。T89雄性無性系繼代前6個開花株系的平均開花率為37.8%，繼代1次后株系平均開花率就下降至16.0%，隨著繼代次數(shù)增加，開花率不斷下降，繼代5次后未發(fā)現(xiàn)開花植株。717雌性無性系繼代前5個開花株系的平均開花率為10.3%，繼代1次后下降至3.0%，繼代2次后未見開花植株。同時，T89雄性轉(zhuǎn)基因植株中會產(chǎn)生少量兩性花 （圖1e），兩性花的比例會隨著繼代次數(shù)的增加而上升。繼代前兩性花比率為11.8%，繼代1次為12.4%，繼代4次后升至39.7%。在楊樹其他開花基因轉(zhuǎn)化中也曾發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)性別轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[19]，目前還不清楚開花基因究竟如何引起兩性花的發(fā)育，以及為何繼代次數(shù)會增加兩性花比例。

2.4 花器官的分化發(fā)生在溫室培養(yǎng)階段

轉(zhuǎn)基因植株在試管培養(yǎng)階段只能形成初始花結(jié)構(gòu)，不能完成花器官的分化。試管內(nèi)開花的轉(zhuǎn)基因植株，如不及時繼代培養(yǎng)或移栽至溫室培養(yǎng)，初級花結(jié)構(gòu)會很快枯萎凋謝，不能繼續(xù)發(fā)育。只有將試管培養(yǎng)完成花芽分化的材料移栽至溫室培養(yǎng)，才能完成花器官的分化。我們將部分試管階段形成初始花結(jié)構(gòu)未凋謝、未繼代的轉(zhuǎn)基因植株，直接經(jīng)煉苗移栽后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)試管階段誘導(dǎo)的初始花結(jié)構(gòu)在移栽至溫室后會繼續(xù)發(fā)育，形成花器官，但發(fā)育不完全，具雌雄蕊、花盤結(jié)構(gòu)，無成熟苞片結(jié)構(gòu)，雄蕊不能成熟發(fā)育（圖1g）。雄株T89轉(zhuǎn)基因株系會產(chǎn)生大量的雄花（圖1d）以及少量兩性花（10%左右）（圖1e），雌株717轉(zhuǎn)基因株系只產(chǎn)生雌花（圖1f）。不論哪種花，均為單朵花，而非野生型的柔荑花序（圖1j）。從試管培養(yǎng)階段初始花結(jié)構(gòu)形成至溫室培養(yǎng)階段花器官的分化需要約5周左右的時間。花器官均產(chǎn)生于初始花結(jié)構(gòu)頂端膨大部位。對于雄花，花藥從花盤中展露約需1周時間；每個花朵會產(chǎn)生3～5枚散生雄蕊，均由1個花絲連接在花盤上，花絲長約0.5 mm，花藥長約0.1～0.3 mm（圖1d）?；ㄋ幫庑胃吧蛥^(qū)別不大，但不能成熟發(fā)育，未發(fā)現(xiàn)散粉現(xiàn)象。兩性花的雄蕊和雄花的大小相當(dāng)，也未見散粉現(xiàn)象，雌蕊很大，子房可達2 mm，紡錘形，沒有明顯的花柱 （圖1e）。雌花子房比兩性花子房大，約3～4 mm（圖1f）。因為一起開放的雄花未能散粉，又未進行人工授粉，所以，兩性花及雌花的胚囊育性未知。

表1 繼代次數(shù)對轉(zhuǎn)基因無性系開花率、兩性花比率的影響Table1 Effects of subculture on flowering frequency and bisexual flower rate of transgenic clones

圖1 35S::FT轉(zhuǎn)基因楊樹早期花發(fā)育及花器官變異Figure1 Flower development and variation of 35S::FT transgenic poplars

2.5 溫室開花后的植株，未能再次開花

溫室培養(yǎng)階段的開花植株，在隨后1 a的繼續(xù)培養(yǎng)中未能再次開花，即使植株高度達1 m以上的植株，也未二次開花。是否因為植株沒有經(jīng)過休眠造成這種現(xiàn)象呢？我們將在溫室生長1 a的35S::FT轉(zhuǎn)基因植株移栽至露天栽培，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一個冬天的低溫休眠處理，第1次開花的轉(zhuǎn)基因植株也未能再次開花。

3 討論

試驗顯示：FT基因在誘導(dǎo)楊樹早期開花方面，確實有明顯促進作用。由于35S啟動子的過量表達，促使FT基因在2月齡試管苗中提前表達而誘導(dǎo)其開花，這將楊樹大田開花所需的8～20 a時間縮短到短短的2個月。然而，35S::FT轉(zhuǎn)基因植株所開的花全為異常的單朵花，而非野生型的柔荑花序。除了胚囊育性不可知之外，所有雄花均不能完全發(fā)育，不能產(chǎn)生花粉。而我們構(gòu)建的熱激啟動子（HSP）驅(qū)動的FT轉(zhuǎn)基因楊樹，盡管花器官變異依然較大，但產(chǎn)生了較多數(shù)量的正常柔荑花序（圖1h和圖1i），且有花粉產(chǎn)生[11，13]。這說明，在以誘導(dǎo)正?；ㄆ鳛槟康霓D(zhuǎn)基因研究中，35S并不是合適的啟動子，盡管該啟動子驅(qū)動的FT轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的早花性，但因其誘導(dǎo)的花發(fā)育不全沒有育性而失去應(yīng)用價值。

35S::FT轉(zhuǎn)基因植株在成花過程的早期，分生組織并不能完全失去營養(yǎng)生長特性，導(dǎo)致花與花之間有較長節(jié)間，且有葉片發(fā)育，形成異常的單朵花，單朵花不能成熟發(fā)育等。這些都暗示了FT基因可能只決定了開花的時間，而不能決定花的正常發(fā)育。在后期，分生組織基本喪失了營養(yǎng)生長特性，形成外觀更像花序的頂端簇生單朵花。這暗示了在后期，可能有別的影響花朵發(fā)育的基因發(fā)揮了作用，促使花的發(fā)育更加趨于正常，而這些開花基因的正常表達，與轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育狀態(tài)有關(guān)。這也說明了為什么轉(zhuǎn)基因植株在試管培養(yǎng)階段只能完成分生組織屬性的改變，形成初始花結(jié)構(gòu)，不能完成花器官的分化與發(fā)育，而在移栽至溫室后會完成花器官的分化發(fā)育過程的原因。

植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換是高等植物開花最重要的過程，開花誘導(dǎo)過程是開花基因在時間和空間上順序表達的結(jié)果，機制十分復(fù)雜，有光周期、春化、自主促進和赤霉素（GA）等多種開花誘導(dǎo)途徑的參與，涉及許多調(diào)控基因[18]。自然界中楊樹必須經(jīng)過8～20 a的營養(yǎng)生長階段之后才能誘導(dǎo)開花，35S::FT雖然可以瞬時過量表達促進轉(zhuǎn)基因楊樹在很早的試管培養(yǎng)階段形成花結(jié)構(gòu)，但似乎很難改變楊樹在長期進化過程中形成的固有開花模式，正常花器的誘導(dǎo)依然離不開植株自身足夠的營養(yǎng)生長，以及在特定發(fā)育階段表達的其他開花基因的調(diào)控。這一點在我們對HSP::FT轉(zhuǎn)基因楊樹的研究中也有發(fā)現(xiàn)，熱激材料的年齡越大，開花率越高，正?；ㄆ鲾?shù)目越多[13]。這也暗示了在開花基因轉(zhuǎn)化研究中，特異性啟動子較組成型啟動子有優(yōu)勢，因為特異性啟動子如HSP可以在植株經(jīng)過足夠的營養(yǎng)生長時間之后再誘導(dǎo)讓其表達，促進開花，而組成型啟動子如35S，這一點似乎很難實現(xiàn)。

以往研究顯示，35S啟動子驅(qū)動的開花基因的表達很不穩(wěn)定，在離體及溫室栽培中促花性能不一，甚至同一開花基因轉(zhuǎn)化不同種植物促花性能也不一樣，開花植株重復(fù)開花率較低，而且會阻遏植物的正常生長發(fā)育等[10,21]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)這種不穩(wěn)定現(xiàn)象，35S::FT轉(zhuǎn)基因楊樹開花率隨著試管苗繼代次數(shù)的增加而下降、溫室培養(yǎng)及轉(zhuǎn)至大田的開花植株也未能再次開花。甚至同樣的實驗材料，我們的結(jié)果與Hoenicka等[10]的研究結(jié)果也不一致，他們在35S::FT轉(zhuǎn)化無性系T89的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在溫室培養(yǎng)階段不能繼續(xù)完成花的發(fā)育。引起這種不穩(wěn)定現(xiàn)象的原因需進一步用實驗證明，Hoenicka等[10]認(rèn)為可能是由于基因沉默或其他開花基因擾亂了35S::FT系統(tǒng)的開花誘導(dǎo)所致。也可能與影響35S啟動子表達的植株發(fā)育階段、光周期、溫度等因素[22]有關(guān)。

總之，植物生長發(fā)育、開花結(jié)實是一個復(fù)雜的生化過程。該過程的正常實現(xiàn)，既與各種相互關(guān)聯(lián)的遺傳基因、環(huán)境因子、遺傳與環(huán)境因子之間的嚴(yán)密調(diào)控有關(guān)，也與長期進化中形成的各種平衡關(guān)系有關(guān)，還與植物的生長發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[4-6，9-10，21-22]。開花基因轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)基因植株早期開花中存在的一系列異?，F(xiàn)象，可能涉及上述任一因素，要揭示其真正原因，需要從分子手段入手，深入探明開花基因及其調(diào)控基因促進開花的機制以及影響花器官正常發(fā)育的基因及其調(diào)控機制。相信楊樹和其他林木以及1年生植物的比較基因組學(xué)和基因組功能的基礎(chǔ)研究，將會幫助找到解決問題的新途徑。或許，其他開花基因（單基因途徑）及啟動子，以及多種開花基因的聯(lián)合使用（基因疊加途徑），是解決這一問題的有效途徑。

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