烏司他丁注射液改善急性肺損傷兔循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管能力及對(duì)PKB／eNOS／NO 通路的影響

王海峰，郭偉新，謝南姿，李 健，沈 藝

急性肺損傷時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）參與到肺泡－毛細(xì)血管的修復(fù)，2008 年內(nèi)皮祖細(xì)胞移植至油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷兔模型［1］的研究已證實(shí)在急性肺損時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞可歸巢到肺毛細(xì)血管，起到修復(fù)肺損傷的作用。烏司他丁注射液（ulinastatin injection，UTI）減輕急性肺損傷程度，現(xiàn)有的研究認(rèn)為烏司他丁可減輕肺部炎癥，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子釋放［2－4］。烏司他丁是否引起肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮改變現(xiàn)暫無(wú)研究。PKB／eNOS／NO 通路在內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力及歸巢有著重要作用［5］，并且最新的研究表明烏司他丁可引起AKT 表達(dá)上升［6］，但未進(jìn)行下游通路的研究，為此，本課題進(jìn)行烏司他丁是否作用于該通路進(jìn)一步研究，觀察烏司他丁注射液對(duì)急性肺損傷循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力及對(duì)PKB／eNOS／NO 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年新西蘭大耳白兔（2.5kg～3.0 kg）共50只（購(gòu)自廣東省動(dòng)物中心），均為雄性，根據(jù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康使用規(guī)范指南飼養(yǎng)，所有操作符合廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的要求。

1.2 材料與試劑 M199培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆惑w外血管形成試劑盒、DIL－labeled acetylated LDL（Dil－acLDL）、FITC 標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ（FITCUEA－1）、Oleicacid（75mg／kg）均購(gòu)自Sigma公司；NO檢測(cè)試劑盒（武漢博士德），烏司他丁注射液（天普洛安）。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共分為5組，每組8只。對(duì)照組：抽取10mL外周血分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞7d后，行內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定。48h 后，檢測(cè)成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表達(dá)水平。急性肺損傷組：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞，48h后，檢測(cè)成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達(dá)水平。烏司他丁治療組：造模成功24h后，抽取10mL外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞加入1 000U／mL烏司他丁培養(yǎng)48h后，檢測(cè)成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表達(dá)水平。烏司他?。玃KB阻斷劑（LY－294002）組：造模成功24h 后，抽取10mL 外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞加入1 000U／mL烏司他丁及LY－294002（5μmol／L）培養(yǎng)48h后，檢測(cè)成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達(dá)水平。烏司他?。玡NOS 阻斷劑（L－NAME）組：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分離誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞加入1 000 U／mL 烏司他丁及LAME（1×104μmol／mL）培養(yǎng)48h后，檢測(cè)成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達(dá)水平。

1.3.2 EPCs的分離培養(yǎng) 肝素抗凝取骨髓10mL，采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種在24孔板上。應(yīng)用M199培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，青霉素100 U／mL，鏈霉素100 U／mL）培養(yǎng)，培養(yǎng)4d 換液，用PBS洗去非貼壁細(xì)胞。換培養(yǎng)液后培養(yǎng)至7d，PBS液去除非貼壁細(xì)胞，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3.3 EPCs的鑒定 按2×106～3×106接種在纖連蛋白包被24孔板，細(xì)胞玻片培養(yǎng)第4天取出，將細(xì)胞與2.4ng／mL的DIL－acLDL在37℃下孵育1h，以檢測(cè)EPCs攝取DIL－acLDL。采用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。應(yīng) 用PBS 清 洗2 min，10ng／mL 的FITC－UEA－1加于上述標(biāo)本，37 ℃下孵育1h。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定DIL－acLDL 和FITC－UEA－1雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.3.4 EPCs血管生成能力檢測(cè) 采用體外血管生成試劑盒檢測(cè)體外EPCs的血管生成能力。200倍倒置顯微鏡下觀察小血管生成情況。細(xì)胞拉長(zhǎng)變形，長(zhǎng)度為寬度的4倍以上即可被認(rèn)為形成小管。選擇200倍光鏡下5個(gè)視野，計(jì)數(shù)小管數(shù)。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)PKB、eNOS、VEGF 蛋白表達(dá)水平 按照參考文獻(xiàn)和本室已經(jīng)建立的常規(guī)方法進(jìn)行。PKB、eNOS、VEGF 各種分子抗體均可通過(guò)商業(yè)化購(gòu)買獲得（Cell Signaling Technology公司。垂直電泳分離蛋白，對(duì)于小分子量蛋白采用半干轉(zhuǎn)（Bio－RAD 半干轉(zhuǎn)儀），而大分子蛋白采用濕轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，相應(yīng)一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，使用對(duì)應(yīng)二抗孵育2h，PBS沖洗后ECL 化學(xué)發(fā)光法曝光感光底片，顯影定影洗滌，掃描底片經(jīng)過(guò)Band Scan圖像分析軟件半定量分析目的蛋白條帶。

1.3.6 采用硝酸還原酶法測(cè)定培養(yǎng)液上清NO 的含量 NO 化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（NO3－）和亞硝酸鹽（NO2－），而NO2－進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3－，利用硝酸還原酶特異性將NO3－還原為NO2－，通過(guò)顯色深淺測(cè)其濃度的高低。測(cè)定方法按照一氧化氮測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定 共聚焦顯微鏡觀察EPCs攝取熒光雙染陽(yáng)性×200DiL－acLDL 染色細(xì)胞呈紅色；FITC－UEA－I染色細(xì)胞呈綠色；雙染色細(xì)胞同時(shí)呈紅、綠色。通過(guò)共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC－UEA－I和DiLacLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

2.2 體外EPCs血管生成能力比較 急性肺損傷組較正常對(duì)照組體外成血管數(shù)目下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；烏司他丁治療組較急性肺損傷組體外成血管數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；烏司他丁＋LY294002組、烏司他?。獿－NAME 組較烏司他丁治療組體外成血管能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組體外成血管數(shù)目比較

表1 各組體外成血管數(shù)目比較

與正常對(duì)照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n 血管數(shù)目正急常性對(duì)肺照損組傷組66 6467..8333±±35..534 51）2）烏司他丁治療組 6 61.67±7.06烏烏司司他他丁丁＋＋LLYN29A4M00E2組組 66 3393..5607±±183.9.2671）12））2）

2.3 PKB、eNOS蛋白表達(dá)比較 急性肺損傷組較正常對(duì)照組PKB、eNOS表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；烏司他丁治療組較急性肺損傷組PKB、eNOS蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；烏司他?。獿Y294002 組、烏司他?。獿－NAME 組PKB、eNOS蛋白表達(dá)較烏司他丁治療組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組PKB、eNOS蛋白表達(dá)比較

表2 各組PKB、eNOS蛋白表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n PKB eNOS正常對(duì)照組 6 0.10±0.05 0.04±0.01急性肺損傷組 6 0.38±0.072） 0.05±0.012）烏司他丁治療組 6 0.64±0.081） 0.18±0.151）烏司他丁＋LY294002組 6 0.31±0.092） 0.06±0.01）2）烏司他?。獿－NAME組 6 0.09±0.022） 0.05±0.01）2）

2.4 NO 含量比較 烏司他丁治療組較急性肺損傷組NO 濃度上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；烏司他?。獿Y294002組、烏司他丁＋L－NAME 組較烏司他丁治療組NO 濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組NO 含量比較 μmol／L

表3 各組NO 含量比較 μmol／L

與正常對(duì)照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n NO正常對(duì)照組 5 6.64±0.47急烏烏烏性司司司肺他他他損丁丁丁傷治＋＋LL組療Y－N 組29 A 4M0 0E2組組 5555 7954....4345 8644±±±±0100....8256 4328 2122））））

3 討 論

通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)直接觀察烏司他丁對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能影響。內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、分化，最終是用于內(nèi)皮修復(fù)及血管新生，而內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力是以上功能的綜合反映，更能體現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。本研究選擇內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)烏司他丁干預(yù)后，兔循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外成血管的能力較急性肺損傷組細(xì)胞成血管功能上升。

在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)同樣發(fā)現(xiàn)烏司他丁組治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力提高，并且這種能力的提高可以被PKB、eNOS阻斷劑阻斷。因此，認(rèn)為烏司他丁作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能改善，修復(fù)肺泡毛細(xì)血管屏障，減少肺部滲出，其機(jī)制可能有PKB／eNOS／NO 通路參與。

烏司他丁改善內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管功能的機(jī)制是因?yàn)槠錅p輕炎癥因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致內(nèi)皮保護(hù)，還是通過(guò)其他途徑導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能改善這是本課題解決的問(wèn)題。已有研究表明PKB／eNOS／NO通路是調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的重要信號(hào)途徑，多種細(xì)胞因子、藥物通過(guò)此信號(hào)通路作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢、分化［7］。烏司他丁是否通過(guò)PKB／eNOS／NO 通路改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能？

本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型中觀察到急性肺損傷肺組織PKB、eNOS減少，經(jīng)烏司他丁治療后兔肺組織PKB、eNOS表達(dá)上升。在體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞檢測(cè)也有同樣的趨勢(shì)。NO 是PKB／eNOS的下游產(chǎn)物，可直接介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能提高［8，9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)在烏司他丁治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞NO 上升，經(jīng)L－NAME、LY294002 阻 斷 劑 后NO 含 量 下 降。在 體外成血管結(jié)果中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管功能在烏司他丁治療后明顯提高與NO 的變化一致。在本研究中急性肺損傷時(shí)NO 較正常對(duì)照組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)烏司他丁治療后這種趨勢(shì)增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在急性肺損傷時(shí)大量的炎癥因子分泌造成內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷，這種損傷導(dǎo)致內(nèi)皮功能下調(diào)，經(jīng)治療可有效改善，在本研究中表現(xiàn)為經(jīng)烏司他丁治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管功能明顯上調(diào)。在本研究中使用了PKB阻斷劑（LY294002）與eNOS阻斷劑（L－NAME），經(jīng)烏司他丁治療后NO 及成血管能力提高，給予PKB阻斷劑后NO 和成血管能力下降，考慮為烏司他丁直接作用于PKB 或PKB 以上的通路，最新的研究也證明烏司他丁可引起PKB表達(dá)上升［6］。

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