基于單核－巨噬細(xì)胞炎癥模型的絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)抗炎機(jī)制初探

楊 然，朱海燕，趙明鏡，高永紅，王 顯

人THP－1細(xì)胞屬于急性髓系白血病細(xì)胞，是體外研究單核－巨噬細(xì)胞功能的良好替代品，該細(xì)胞經(jīng)佛波酯（PMA）誘導(dǎo)后分化為巨噬細(xì)胞［1］，而巨噬細(xì)胞能夠分泌腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白細(xì)胞介素6（IL－6）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生和發(fā)展。含藥血清能更好地反映藥物尤其是中藥復(fù)方在體內(nèi)通過(guò)血液循環(huán)產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，有利于從細(xì)胞水平上探討中藥復(fù)方的作用機(jī)制，理論上提高了體外實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和可靠性。王顯教授在學(xué)習(xí)和總結(jié)古今醫(yī)家理論及經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的病因病機(jī)及其中西醫(yī)結(jié)合防治策略進(jìn)行創(chuàng)新性思考和探索，提出動(dòng)脈粥樣硬化“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”學(xué)說(shuō)［2］，指出“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”乃急性冠脈綜合征的重要病機(jī)之一，并創(chuàng)制絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)方用于冠心病不穩(wěn)定型心絞痛的治療，前期研究已證明絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)方可顯著改善不穩(wěn)定型心絞痛的臨床癥狀，但其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。結(jié)合既往研究，推測(cè)其通過(guò)抑制血管內(nèi)炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮作用。本研究通過(guò)脂多糖（LPS）刺激人單核－巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型，采用血清藥理學(xué)方法，以期為研究絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)的抗炎作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 所用中藥均來(lái)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。匹伐他汀鈣片（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20080737）；佛波酯（PMA）（P1585）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脂多糖（tlrl－eblps）及Triozol Reagent均為Invivogen Life technologies產(chǎn)品；Human TNF－αELISA kit（EHC103a.48）購(gòu)自欣博盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 動(dòng)物與細(xì)胞 SD（Sprague－Dawley）雄性大鼠24只，體重250g±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)為SCXK（京）2012－0009。THP－1單核細(xì)胞由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MultiSkan FC 酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 24只SD 雄性大鼠，隨機(jī)分為空白組、絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)組和匹伐他汀鈣組，分別以生理鹽水、15倍于人的絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)藥液及15倍于人的匹伐他汀鈣藥液灌胃，劑量為1.2mL／100g，每日1次，連續(xù)7d。于末次給藥2h后，腹主動(dòng)脈采血，3 000g常溫離心后取上清液，收集各組含藥血清，56 ℃水浴30 min，滅活補(bǔ)體后分裝于1.5 mL EP 管中，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基重懸原代細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2d換1次液，4d傳1次代。選用6代～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 確定PMA最佳誘導(dǎo)濃度 調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×105個(gè)／L，接種于96孔板，每每孔100μL；每孔加入等體積的不同濃度PMA 溶液，使其終濃度分別為40nmol／L、80nmol／L、160nmol／L、320nmol／L、640nmol／L，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，分別誘導(dǎo)24h 及48h。棄上清，每孔加入100 μL 1mg／mL MTT 培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后；棄上清，每孔加150μL DMSO，振蕩5min～10min，于酶標(biāo)儀550nm 處測(cè)各孔A 值。

1.2.4 確定絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)方含藥血清最佳作用濃度向已分化好的巨噬細(xì)胞中依次加入5%空白血清、5%中藥血清、5%西藥血清、10%空白血清、10%中藥血清、10%西藥血清、15%空白血清、15%中藥血清、15%西藥血清、20%空白血清、20%中藥血清、20%西藥血清。每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育24h。

1.2.5 確定LPS最佳刺激濃度 向已分化好的巨噬細(xì)胞中加入100μL 濃度分別為20ng／mL、200ng／mL、2μg／mL、20μg／mL的LPS溶液，同時(shí)加入等體積含20%空白對(duì)照血清的培養(yǎng)基，則LPS終濃度分別為10ng／mL、100ng／mL、1μg／mL、10μg／mL，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，共同孵育24h。1.2.6 細(xì)胞上清MMP－9水平檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，實(shí)驗(yàn)分組詳見(jiàn)表1。分別收集各組細(xì)胞上清液至無(wú)菌EP管中，置于－20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，1d～2d內(nèi)檢測(cè)完畢。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及用藥

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 倒置顯微鏡鏡下觀察，剛復(fù)蘇的THP－1單核細(xì)胞為非貼壁形式生長(zhǎng)，體積較小，為圓形；培養(yǎng)4 8h后，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞密度也增大。

2.2 不同濃度及時(shí)間PMA 對(duì)THP－1細(xì)胞增殖的影響 誘導(dǎo)24h、48h，PMA40nmol／L組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PMA80nmol／L 組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），且誘導(dǎo)24h時(shí)明顯高于誘導(dǎo)48h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。故以PMA 80nmol／L誘導(dǎo)24h為最佳誘導(dǎo)條件。詳見(jiàn)表2。

表2 不同濃度及時(shí)間PMA 對(duì)THP－1細(xì)胞增殖的影響

表2 不同濃度及時(shí)間PMA 對(duì)THP－1細(xì)胞增殖的影響

與同組誘導(dǎo)48h比較，1）P ＜0.05；與對(duì)照組比較，2）P ＜0.01。

組別 n 誘導(dǎo)24h 誘導(dǎo)48h對(duì)照組6 0.130±0.085 0.120±0.006 PMA40nmol／L組 6 0.140±0.036 0.130±0.007 PMA80nmol／L組 6 0.150±0.0121）2）0.140±0.008 PMA160nmol／L組 6 0.140±0.011 0.130±0.006 PMA320nmol／L組 6 0.140±0.01 0.130±0.009 PMA640nmol／L組 6 0.130±0.007 0.130±0.005

2.3 不同濃度含藥血清對(duì)THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響 5%濃度的各組含藥血清對(duì)細(xì)胞有顯著增殖作用，與空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），故不選此濃度；10%濃度的中藥血清與10%濃度的空白血清相比抑制細(xì)胞增殖（P ＜0.01）；15%與20%空白血清組與5%空白血清組相比，則顯示出血清對(duì)細(xì)胞的毒性（P ＜0.01）；故以10%濃度的含藥血清為最佳濃度。詳見(jiàn)表3。

表3 不同濃度含藥血清抑制人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的比較

表3 不同濃度含藥血清抑制人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的比較

與5%空白血清組比較，1）P ＜0.01；與10%空白血清組比較，2）P ＜0.01。

組別 人THP－1源性巨噬細(xì)胞55%%空中白藥血血清清組組00..345100±±00..00351 41）5%西藥血清組 0.340±0.019 1100%%空中白藥血血清清組組 00..335100±±00..00210 52）1105%%西空藥白血血清清組組 00..330000±±00..00334 01）15%中藥血清組 0.290±0.014 1250%%西空藥白血血清清組組 00..323600±±00..00228 61）20%中藥血清組 0.260±0.028 20%西藥血清組 0.270±0.031

2.4 不同濃度LPS對(duì)人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響 LPS可刺激細(xì)胞增殖，1μg／mL 組與對(duì)照組相比有明顯增殖作用（P ＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

表4 不同濃度LPS對(duì)人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響

表4 不同濃度LPS對(duì)人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，1）P ＜0.01。

組別 人THP－1源性巨噬細(xì)胞對(duì)照組0.200±0.018 10ng／mL組 0.200±0.014 100ng／mL組 0.220±0.015 1μg／mL組 0.340±0.0261）10μg／mL組 0.260±0.0201）

2.5 絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)含藥血清對(duì)單核－巨噬細(xì)胞MMP－9表達(dá)的影響 炎癥因子MMP－9的表達(dá)水平模型組明顯高于空白組（P ＜0.01），中藥血清高濃度組及西藥血清組低于模型組（P ＜0.01）；隨著中藥各組含藥血清液濃度的增加，MMP－9的表達(dá)逐漸降低（P ＜0.05）。詳見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞上清液MMP－9水平比較 ng／mL

表5 各組細(xì)胞上清液MMP－9水平比較 ng／mL

與空白組相比，1）P ＜0.01；與模型組相比，2）P ＜0.01。

組別 n MM－9空白組3 3.800±0.681模型組 3 5.200±0.6361）中藥血清（低）組 3 4.640±0.171中藥血清（中）組 3 4.170±0.2742）中藥血清（高）組 3 3.380±0.1032）西藥血清組 3 2.570±0.5272）

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊從穩(wěn)定變?yōu)橐讚p的過(guò)程涉及炎癥、免疫、代謝、凝血等多個(gè)環(huán)節(jié)，其中炎癥反應(yīng)是引起斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素［3］。人THP－1細(xì)胞作為體外研究單核－巨噬細(xì)胞功能的良好替代品，經(jīng)PMA 誘導(dǎo)后分化為巨噬細(xì)胞［1］，而巨噬細(xì)胞能夠分泌TNF－α、IL－6和MMPs等多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子。噻唑藍(lán)（MTT）法是一種用于檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)的簡(jiǎn)便方法，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比［4］，據(jù)此可檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

首先，篩選PMA 的最佳作用濃度。研究表明［5，6］，PMA 可 以 使 體 外 培 養(yǎng) 的 單 核 細(xì) 胞 分 化 為 巨 噬細(xì)胞。由于THP－1單核細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活相對(duì)數(shù)，就能夠反映經(jīng)PMA 誘導(dǎo)后單核細(xì)胞的貼壁情況，即巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取不同濃度的誘導(dǎo)劑及不同的誘導(dǎo)時(shí)間，篩選出巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高的PMA 濃度，即為最佳誘導(dǎo)濃度。而含胎牛血清的完全培養(yǎng)基使細(xì)胞不斷增殖，不利于單核細(xì)胞貼壁分化［1］，故本實(shí)驗(yàn)選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞貼壁分化｛JP3。對(duì)于PMA 的誘導(dǎo)濃度，文獻(xiàn)一般采用80nmol／L～200nmol／L濃度誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，其中選用80nmol／L～160nmol／L濃度居多，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)定40nmol／L、80nmol／L、160 nmol／L、320nmol／L、640nmol／L 5個(gè)濃度梯度。PMA作用24h后，在40nmol／L～80nmol／L 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨PMA 濃度升高而升高，在160nmol／L～640 nmol／L 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨PMA 濃度升高而降低。作用48h后，隨PMA 濃度的升高巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率變化趨勢(shì)與作用24h的相同；但在相同濃度下，作用48 h巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低于作用24h。THP－1單核細(xì)胞與PMA（80nmol／L）培養(yǎng)24h，由懸浮細(xì)胞向貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化，呈阿米巴樣生長(zhǎng)，并伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)化率達(dá)90%。所以本實(shí)驗(yàn)選擇80nmol／L 作為誘導(dǎo)THP－1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的最終濃度。

其次，確定了含藥血清的最佳濃度。血清藥理學(xué)是指用含有藥物成分的血清施加于體外實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5%濃度的各組含藥血清對(duì)細(xì)胞有顯著增殖作用，與空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），故不選此濃度；10%中藥血清組與10%空白血清組相比抑制細(xì)胞增殖（P ＜0.01）；15%與20%空白血清組與5%空白血清組相比，則顯示出血清對(duì)細(xì)胞的毒性（P ＜0.01）。故以10%濃度的含藥血清為最佳濃度。

在確定以上兩個(gè)濃度的基礎(chǔ)上，確定最佳造模濃度。LPS、絲裂原即有絲分裂原，因可導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂而得名，包括LPS、美洲商陸（PWM）、刀豆蛋白A（ConA）等。LPS在體內(nèi)與可溶性CD14（sCD14）或細(xì)胞 膜 上 的 CD14（membrane－boundCD14moleeule，mCD14）受體結(jié)合，形成LPS 蛋白復(fù)合物（LpSbindingprotein，LBP），激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。有研究表明［8－10］，LPS濃度在1μg／mL、作用24h可充分誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞。LPS 通過(guò)與TLR4 受體結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF－κB激活是引起大量炎性介質(zhì)表達(dá)的重要始動(dòng)因素［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS 可刺激細(xì)胞增殖，10ng／mL與100ng／mL 組與對(duì)照組相比，細(xì)胞無(wú)明顯增殖（P ＞0.05）；1μg／mL 組與對(duì)照組相比有明顯增殖作用（P ＜0.01），故以1μg／mL的LPS為最佳造模濃度。經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，單核－巨噬細(xì)胞炎癥模型制備成功，并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性、動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的炎癥性疾病。針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究難點(diǎn)以及動(dòng)脈粥樣硬化引起急性心腦血管事件的發(fā)病特點(diǎn)，王顯教授提出動(dòng)脈粥樣硬化“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”學(xué)說(shuō)［12－14］，經(jīng)過(guò)10余年的臨床研究，認(rèn)為絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)乃是急性心腦血管事件的重要病機(jī)，并在該學(xué)說(shuō)指導(dǎo)下，研制出以祛風(fēng)除濕、益氣活血為主要功效的絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)方，強(qiáng)調(diào)在益氣活血同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)“風(fēng)藥”的使用。該方以徐長(zhǎng)卿、威靈仙、黨參、黃芪為主藥，方中藥物可能通過(guò)抗炎、調(diào)脂、抗栓、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用穩(wěn)定斑塊，防止急性冠脈綜合征的發(fā)作。

基質(zhì)降解是動(dòng)脈粥樣硬化高風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志，導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)。基質(zhì)金屬蛋白酶是影響動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的重要生物酶，能夠特異性的與細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，導(dǎo)致斑塊纖維帽降解和斑塊破損［15］。

Peter等［16］在apoE－／－小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)MMP－9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)活化的MMP－9時(shí)顯著增加彈力蛋白的降解，誘導(dǎo)有效的斑塊破裂。敲除TLR4的ApoE－／－小鼠模型顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積明顯減少，斑塊中的脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)均降低，顯著下調(diào)了促炎因子表達(dá)水平，從而使斑塊趨于穩(wěn)定而不易破裂［17］。Blich等［18］將實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的結(jié)果相互驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF－α、MMP－9、IL－1與單核細(xì)胞趨化蛋白－1水平明顯增加，而TLR2和TLR4基因敲除后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中上述細(xì)胞因子無(wú)明顯增加。臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血漿類肝素酶水平與穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人相比明顯升高，而且肝素酶染色的易損斑塊與穩(wěn)定斑塊的病理標(biāo)本中，易損斑塊的肝素酶染色是增加的。由此得出被激活的巨噬細(xì)胞過(guò)量分泌相關(guān)炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致斑塊易損性增強(qiáng)，并可能與TLR2和TLR4基因調(diào)控有關(guān)。也有實(shí)驗(yàn)證明，激活TLR2、TLR4、TLR9 可上調(diào)MMP－1、MMP－2、MMP－3、MMP－8、MMP－9mRNA 的表達(dá)［19］。其中MMP－9與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切，可作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的標(biāo)志物［20］。目前證實(shí)LPS通過(guò)TLR4介導(dǎo)MMP－9及蛋白水解酶表達(dá)［21］，兩者可降解細(xì)胞外基質(zhì)引發(fā)AS 斑塊不穩(wěn)定［22，23］。因此，基于單核－巨噬細(xì)胞炎癥模型的成功制備，觀察絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)含藥血清對(duì)炎癥因子MMP－9表達(dá)的影響，結(jié)果表明：絡(luò)風(fēng)寧1號(hào)含藥血清呈劑量依賴型抑制MMP－9表達(dá)。但其通過(guò)何種調(diào)控機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用仍不清楚，可能通過(guò)抑制TLR4／NF－κB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化來(lái)發(fā)揮抗炎作用。

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