腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)凍干保護(hù)劑的設(shè)計(jì)

柯 璐 黃曉蓉 戴曉麗 林 杰 張溫玲 曾維揚(yáng)

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建福州 350003）

1 前言

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Reference Material，RM) 在提高實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試水平和科研能力上有重要作用，是各種檢測(cè)技術(shù)高效、準(zhǔn)確運(yùn)行的重要前提和保障[1]。菌種RM是生物特性RM中較為特殊的一類，微生物的生長(zhǎng)及其特性的保持都與RM的制備條件和保存方法緊密相關(guān)[2]。冷凍真空干燥保存法是目前保存菌種的最佳方法，具有適用范圍廣、保藏期長(zhǎng)、成活率高、保藏期內(nèi)可避免其它雜菌污染、便于攜帶運(yùn)輸及易實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)[3]。此外，為更好地符合微生物檢測(cè)實(shí)際狀況，在研究制備微生物RM中，國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)已經(jīng)采用含食品基質(zhì)的微生物測(cè)試樣品[4-5]。影響凍干細(xì)菌存活率的一個(gè)重要因素就是凍干保護(hù)劑。本試驗(yàn)選用蔗糖、脫脂乳、谷氨酸鈉及聚乙烯吡咯烷酮四種保護(hù)劑，并分別設(shè)計(jì)2個(gè)添加水平，采用正交法進(jìn)行保護(hù)劑的配方試驗(yàn)，利用SPSS分析結(jié)果本試驗(yàn)選用雞肉作為基質(zhì)，將雞肉基質(zhì)、配方保護(hù)劑及菌液按設(shè)計(jì)的比例混合凍干，檢測(cè)RM含菌數(shù)批次內(nèi)、外的均勻性，及保存一定時(shí)期的穩(wěn)定性，分析優(yōu)化的凍干保護(hù)劑是否具有一定價(jià)值。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌源及基質(zhì)來(lái)源

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，簡(jiǎn)稱：SE）菌種：ATCC13076，購(gòu)自上海漢尼公司；雞肉：購(gòu)自福建圣農(nóng)集團(tuán)，取雞胸脯肉，低溫運(yùn)輸，使用前存儲(chǔ)于-20℃。

2.1.2 儀器

2.1.3 主要試劑與材料

緩沖蛋白胨：北京陸橋技術(shù)有限公司；蔗糖：西隴化工股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-谷氨酸鈉：阿拉丁試劑上海有限公司；德運(yùn)脫脂牛奶：富祺仕貿(mào)易有限公司；沙門顯色培養(yǎng)基：法國(guó)CHROMagar公司；菌落計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；西林瓶及丁基膠塞：5mL；耐高溫PP塑料瓶：50mL；無(wú)菌均質(zhì)袋：17 cm×30 cm，圣克魯斯生物技術(shù)公司。

2.2 方法

2.2.1 配方保護(hù)劑的選擇

2.2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交法試驗(yàn)：脫脂牛奶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和L-谷氨酸鈉分別記為因素A、B、C、D，各取3個(gè)不同水平，各保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)及凍干保護(hù)的作用，這些因素之間交互影響甚小，故選用L9（34）正交表(見(jiàn)表2)。

表1 保護(hù)劑水平設(shè)計(jì)表

表2 保護(hù)劑正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

按照表 2 的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行9組保護(hù)劑配方的凍干試驗(yàn)，以保護(hù)率為指標(biāo)進(jìn)行分析。

保護(hù)率（%）=（凍干前菌數(shù)-凍干后菌數(shù)）×100%/凍干前菌數(shù)

通過(guò)以上分析可以發(fā)現(xiàn)，任何的語(yǔ)言范疇都不是單一原因造成的，語(yǔ)言范疇的形成要受到語(yǔ)言外部和語(yǔ)言內(nèi)部多種因素的影響和制約，因此以上促動(dòng)因素經(jīng)?？梢怨餐饔糜谀骋环懂牭臄U(kuò)展，以達(dá)到人們想要的表達(dá)效果。

2.2.1.2 冷凍干燥及細(xì)菌存活率的計(jì)算

將細(xì)菌接種于20mL BPW，36℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期（培養(yǎng)時(shí)間為15-18h），利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600值，按照菌濃度曲線方程預(yù)測(cè)菌液凍干前濃度（CFU/mL）。

Y=9.6634 X+8.0385

注：Y值為菌濃度（CFU/mL）的對(duì)數(shù)值，X為菌液OD600。

吸取新鮮培養(yǎng)菌液（約109CFU/mL）100μL分別與9種20mL的配方充分混勻，以2mL/支，分裝于無(wú)菌西林瓶，-70℃預(yù)凍16h，按照冷凍干燥機(jī)操作規(guī)范進(jìn)行冷凍干燥。按照GB 4789.2-2010計(jì)算凍干后菌數(shù)[6]。

2.2.2 雞肉基質(zhì)的前處理及凍干后復(fù)水量計(jì)算

將雞肉切成小塊，剪除脂肪組織，分批次攪碎。100g/袋分裝于5#自封袋，-20℃短期保存。經(jīng)處理的雞肉糜，按照SN/T 1750-2006及SN/T 2127-2008進(jìn)行抗生素四大類及氨芐青霉素、羥氨芐青霉素殘留檢測(cè)，判定結(jié)果均為陰性[7]。選擇鈷-60滅菌（雞肉糜的菌落數(shù)級(jí)為10-4，鈷-60輻射劑量選擇6KGY）[8]。使基質(zhì)達(dá)到試驗(yàn)基質(zhì)無(wú)菌的要求。

將肉糜稱于50mL 耐高溫PP塑料瓶，25g/瓶，瓶螺口蓋松旋，于-70℃冰箱預(yù)凍8h，放入冷凍干燥機(jī)中按照規(guī)定程序抽真空[9]，脫水率（%）=72.00%，因此凍干RM復(fù)原時(shí)，需加18mL無(wú)菌水。

2.2.3 RM的制備及凍干后細(xì)菌存活率計(jì)算

取新鮮培養(yǎng)菌液，根據(jù)菌濃度曲線公式，計(jì)算菌濃度，作適當(dāng)稀釋后與保護(hù)劑配方混合（V1：V2=1：200），制成混合液。稱取基質(zhì)25g于無(wú)菌PP瓶，加入6mL混合液，混合液菌數(shù)為C1（CFU），輕輕旋上瓶蓋，于-70℃預(yù)凍7h后于冷凍干燥機(jī)上凍干。凍干后旋緊瓶蓋，裝入鋁箔袋中，在真空封口機(jī)上封口，于-20℃保存。

吸取18mL pH=7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)凍干物進(jìn)行復(fù)水，將溶解物全部倒入無(wú)菌帶濾膜均質(zhì)袋中，拍擊均質(zhì)1min，將溶解物全部洗入盛有225mL PBS的瓶中，充分搖勻，按GB 4789.2-2010進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果記為S（CFU/g）。最終凍干后RM的菌數(shù)記為C2（CFU）。

C2=25 S

保護(hù)率（%）=（ C1-C2）× 100%/C1

3 結(jié)果與分析

3.1 保護(hù)劑配方的選擇及優(yōu)化

3.1.1 保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 L9（34）正交表 保護(hù)劑與SE的試驗(yàn)結(jié)果

3.1.2 利用SPSS中“General Linear Models”菜單下的“Univariate”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

表4 方差分析

由表4 可知，蔗糖的P＜0.05，即蔗糖對(duì)細(xì)菌保護(hù)率具有顯著影響，脫脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮以及L-谷氨酸鈉的P＜0.01，3種保護(hù)劑對(duì)細(xì)菌保護(hù)率均具有極顯著影響。

表5 單因素統(tǒng)計(jì)（保護(hù)率，95%可信區(qū)間）

（續(xù)表）

表5顯示了各保護(hù)劑不同水平的平均值，結(jié)果可知，各保護(hù)劑不同水平保護(hù)率強(qiáng)弱順序是：A3>A2>Al，B1>B2=B3，C1>C2>C3，D2>D3>D1。選擇各保護(hù)劑中保護(hù)率最大的水平進(jìn)行組合，則最佳保護(hù)劑配方水平組合為：

A3B1C1D2，即 20%脫脂牛奶、10%蔗糖、8%聚乙烯吡咯烷酮和3%L-谷氨酸鈉。

3.2 RM的均勻性

共進(jìn)行了6個(gè)批次的成品制備，各抽取15份，

進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果如表6。

表6 重復(fù)性和再現(xiàn)性

從表6 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，批次重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.185%，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.080%，表明本法具有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

表7 方差分析

由表7 說(shuō)明批次間和批次內(nèi)的含量差異不顯著，這表明所研制的RM中SE的含量是均勻的。

3.3 RM的穩(wěn)定性

從RM中定期任取3袋，按定值方法測(cè)定菌數(shù)。根據(jù)菌數(shù)隨時(shí)間的變化來(lái)分析RM的穩(wěn)定性。

以時(shí)間為橫坐標(biāo)以RM的菌數(shù)為縱坐標(biāo)繪制曲線如圖1所示。

圖1 RM樣品穩(wěn)定性

從上述曲線來(lái)看RM在第一周內(nèi)菌數(shù)大幅度下降，很不穩(wěn)定。而之后在第190天可以穩(wěn)定在800CFU/份。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)展開對(duì)腸炎沙門氏菌RM制備技術(shù)的研究，在菌種凍干樣品制備的基礎(chǔ)上，添加實(shí)物食品作為基質(zhì)，配以保護(hù)劑對(duì)菌株進(jìn)行冷凍干燥，并針對(duì)制備方法及操作等重要環(huán)節(jié)進(jìn)行不確定度評(píng)估，對(duì)樣品定值。建立了含雞肉基質(zhì)的腸炎沙門氏菌菌體RM的研制方法，RM的均勻性良好，菌體RM在-20℃下的短期保存均具有良好的穩(wěn)定性，通過(guò)特征性驗(yàn)證，研制的RM具有腸炎沙門氏菌的特征性。希望本研究研制的RM能夠發(fā)揮鑒定、評(píng)價(jià)、分析、安全監(jiān)控等用途，為生物特性RM的研制提供參考價(jià)值。

［1］Kauff mann F.The bacteriology of Enterobacteriaceae[J].Munksagaard,Copenhagen,1996.

［2］Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) Plan for Program Priorities,2013-2014[EB/OL].(2013.09.04/)[2013.10.20].http://www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/OfficeofFoods/CFSAN/WhatWeDo/ucm366279.htm

［3］張潔.生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、發(fā)展及管理[J].中國(guó)生物制藥學(xué)志，2007，20（6）：630-632.

［4］王晶.生物計(jì)量:一個(gè)嶄新的科學(xué)領(lǐng)域[J].中國(guó)計(jì)量，2004，3：5.

［5］Leszek A.Dobrzanski.Significance of materials science for the future development of societies[J].Journal of Materials Processing Technology,2006:133-148.

［6］GB 4789.2-2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S].

［7］SNT 1750-2006 抗生素類檢測(cè) MIA法[S].

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