固相萃取-氣相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量

曾 靜 時(shí)逸吟* 張孝剛 唐 玲 朱 堅(jiān) 伊雄海 鄧曉軍 曲 栗

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局 上海 200135；2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院）

1 前言

肌醇（Inositol）又叫1α，2α，3α，4β，5α，6β-環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，結(jié)構(gòu)式如圖1。肌醇是飽和環(huán)狀多元醇，易溶于水，廣泛存在于各種天然動(dòng)物、植物及微生物組織中[1]，具有類似維生素B1和維生素H的作用，能促進(jìn)脂肪代謝，防止肝臟脂肪積累，加速除去肝臟過多脂肪，對(duì)脂肪肝、肝炎、肝硬化癥、糖尿病、肥胖癥等疾病有治療和預(yù)防作用[2]。因此，肌醇可作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑，被允許在調(diào)制乳粉（僅限兒童用乳粉）、果蔬汁（肉）飲料（包括發(fā)酵型產(chǎn)品等）和風(fēng)味飲料限量添加[3]，其中國家標(biāo)準(zhǔn)《嬰幼兒配方食品》（GB 10765-2010）規(guī)定嬰幼兒配方食品中肌醇的添加量為1.0-9.5mg/100kJ[4]。

圖1 肌醇分子結(jié)構(gòu)

目前有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的肌醇檢測(cè)方法有重量法、高碘酸鉀氧化法、微生物法、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GCMS/MS）[5-14]。這些方法中，重量法所需樣品量大，操作繁瑣；高碘酸鉀氧化法需要嚴(yán)格控制加熱氧化時(shí)間；微生物法耗時(shí)長(zhǎng)；HPLC法的分離效果不如GC法，檢測(cè)結(jié)果誤差較大。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定》（GB 5413.25-2010）[15]明確規(guī)定嬰幼兒食品和乳品中肌醇含量的測(cè)定方法為微生物法和氣相色譜法

，國家推薦標(biāo)準(zhǔn)《保健食品中肌醇的測(cè)定》（GB/T 5009.196-2003）[5]采用的方法也是硅烷化處理后氣相色譜檢測(cè)法。但是由于奶粉基質(zhì)復(fù)雜，雜峰會(huì)干擾目標(biāo)化合物，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)步驟，采用固相萃取技術(shù)，以期通過優(yōu)化肌醇測(cè)定的前處理過程，找到現(xiàn)有方法中雜峰干擾的解決辦法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)材料市售奶粉。

2.1.2 試劑

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，購自Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、正己烷、無水乙醇：均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.1.3 儀器設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀：帶FID檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；centrifuge 5810R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；氮吹儀：美國Zymark公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；渦旋振蕩器：VISION SCIENTIFIC CO.，LTD；超聲波清洗儀：德國Elmasonic；LC-Florisil固相萃取小柱（1g/3mL）、LC-CN固相萃取小柱(1g/3mL)：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

2.2 方法

2.2.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.010mg/mL）配制

稱取100mg（精確到0.1mg）肌醇標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)105℃烘干2h，用25mL水溶解完全，95%乙醇定容至100mL；取1mL此溶液，用70%乙醇定容至100mL。

2.2.2 氣相色譜條件

色譜柱：SP-2560毛細(xì)管柱（100m×0.25mm，0.2μm）；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：10:1；柱溫：120℃保持0min，以10℃/min升到190℃，保持20min，再以10℃/min升到220℃，保持3min；檢測(cè)器：FID（氫火焰離子檢測(cè)器），溫度300℃；H2流量：30mL/min；空氣流量：400mL/min；尾吹流量（N2）：25mL/min。

2.2.3 樣品處理

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.25-2010[5]。稱取試樣1g(精確到0.0001g)于50mL容量瓶中，加入12mL40℃溫水溶解試樣；超聲提取10min，用95%乙醇定容；取10mL于15mL離心管中，離心5min；取上清液5mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入10mL硅烷化試劑，超聲溶解，于80℃水浴中衍生反應(yīng)75min；取出冷卻至室溫，加入5mL正己烷，振蕩混合，取上清液供氣相色譜測(cè)定。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于濃縮瓶中，按照2.2.3步驟操作。

2.2.5 固相萃取柱的選擇及凈化條件和步驟

分別采用LC-CN固相萃取小柱和LC-Florisil固相萃取小柱凈化處理樣品后，再進(jìn)行干燥與衍生的后續(xù)分析。固相萃取凈化條件和步驟：選用5mL乙醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化，5mL 70%乙醇進(jìn)行平衡，然后加1mL提取液上樣，先以1mL 乙醇淋洗，棄去淋洗液，再以2mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液。

2.2.6 樣品測(cè)定

分別將待測(cè)液注入到氣相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行分析。

2.2.7 結(jié)果計(jì)算

外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中肌醇含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定，以肌醇濃度（0，0.004mg/mL，0.008 mg/mL，0.012 mg/mL，0.016 mg/mL，0.02 mg/mL）為橫坐標(biāo)，以氣相色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制肌醇含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的代表性圖譜如圖3。

圖2 肌醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定代表性圖譜（肌醇濃度0.016mg/mL）

圖2顯示，在0-0.02 mg/mL范圍內(nèi)，肌醇濃度和肌醇檢測(cè)色譜峰面積具有良好的線性相關(guān)性，r為0.9996。在此濃度范圍內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肌醇的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

3.2 不同固相萃取柱處理樣品對(duì)肌醇測(cè)定的影響

通過添加10 mg/100g水平，比較國標(biāo)法（不經(jīng)固相萃取柱凈化）和本方法（經(jīng)凈化）的分析結(jié)果（圖4）以及LC-CN Spe小柱和LC-Florisil Spe小柱柱效（圖5）。

圖4 未經(jīng)SPE凈化與經(jīng)凈化對(duì)樣品處理對(duì)比圖

圖5 兩種小柱對(duì)樣品凈化效果對(duì)比圖

圖4顯示，國標(biāo)法中由于樣品不經(jīng)凈化處理，所以雜峰較多，對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定有一定干擾，樣品出峰前有其他尾峰影響峰面積；本方法中經(jīng)凈化處理的樣品雜峰較少，受樣品基質(zhì)影響小。圖5顯示，兩種小柱對(duì)樣品凈化效果無顯著差異，均能達(dá)到對(duì)實(shí)際樣品的凈化，減少雜質(zhì)。實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)見表1。

表1 2種固相萃取小柱分析結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[16]，回收率最好在95-105%。表1顯示，LC-CN 固相萃取小柱表觀回收率較高，超過105%，這可能是凈化不完全導(dǎo)致；而LC-Florisil 固相萃取小柱回收率基本在95-105%范圍內(nèi)，同時(shí)過LC-Florisil固相萃取小柱比LC-CN固相萃取小柱快。這是因?yàn)榧〈际菢O性物質(zhì)，LC-Florisil固相萃取柱是極性柱，經(jīng)淋洗后試樣中的肌醇被LC-Florisil固相萃取柱吸附，而雜質(zhì)則隨淋洗液流出并棄之。

3.3 衍生前后固相萃取處理樣品對(duì)肌醇測(cè)定的影響

根據(jù)國標(biāo)中肌醇的測(cè)定步驟，選擇LC-Florisil固相萃取小柱、固相萃取凈化條件和步驟，分別于衍生前處理樣品和衍生后處理樣品，分析2種處理對(duì)分析結(jié)果的影響。測(cè)定結(jié)果見表2，分析圖譜見圖6。

表2 衍生前后固相萃取處理樣品對(duì)肌醇測(cè)定的影響

圖6 衍生前后固相萃取處理樣品對(duì)肌醇測(cè)定的影響

通過分析可知，衍生前凈化與衍生后凈化對(duì)樣品中肌醇含量測(cè)定結(jié)果的影響無顯著差異，均具有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。但僅從數(shù)字看，衍生前進(jìn)行樣品凈化具有更好的效果。

3.4 實(shí)際樣品測(cè)定

采用國標(biāo)法和本方法（選擇LC-Florisil 固相萃取小柱）分別對(duì)樣品1、樣品2進(jìn)行不同添加水平（樣品1：5mg/100g，10mg/100g；樣品2：10mg/100g）測(cè)定，結(jié)果見表3（每個(gè)結(jié)果均為6次平行測(cè)定的均值）。

表3 2種方法對(duì)實(shí)際樣品中肌醇含量的測(cè)定結(jié)果（mg/100g）

表3顯示，采用國標(biāo)法測(cè)定樣品中肌醇含量，回收率為99-100%，各次重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差<5%；而本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，平均回收率為95%-98%，各次重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差也<5%，與國標(biāo)法相比，沒有顯著性差異。

基于本方法能夠除掉樣品中大部分雜質(zhì)，減少雜質(zhì)峰的干擾以及對(duì)儀器的損傷，因此可采用本方法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的肌醇含量。

4 結(jié)論

本研究采用LC-Florisil 固相萃取小柱對(duì)試樣進(jìn)行凈化處理，濃縮，經(jīng)硅烷化試劑衍生，處理好的試樣供氣相色譜儀（帶FID檢測(cè)器）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，本方法能夠除掉樣品中大部分的雜質(zhì)，色譜雜峰較少，受樣品基質(zhì)影響小，樣品檢測(cè)結(jié)果回收率在95%-98%，且各次重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差<5%，可以滿足奶粉樣品中肌醇含量的準(zhǔn)確測(cè)定；分別采用國標(biāo)法和本方法對(duì)樣品中肌醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。

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