急性腦梗死患者血清炎癥因子mRNA 表達(dá)與頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)關(guān)系的臨床研究

孫志華，李 蘭，康志新，賀 婕

頸動(dòng)脈斑塊形態(tài)、粥樣硬化的嚴(yán)重程度以及是否容易脫落成栓子等，在腦梗死的發(fā)病中起重要作用。炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管病病理?yè)p害的作用和地位日益受到人們的認(rèn)可，眾多炎癥因子在此過(guò)程中起著重要的作用。本研究觀察急性腦梗死患者血清炎癥因子基因表達(dá)水平與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系，為探索腦梗死有效的臨床干預(yù)措施提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組：急性腦梗死患者128例，符合下列條件：發(fā)病48h內(nèi)入院；符合第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)頭CT 和／或磁共振成像（MRI）證實(shí)；初發(fā)腦梗死，既往無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤；發(fā)病前后存在感染者；發(fā)病前后使用激素、免疫抑制劑、非甾體類(lèi)抗炎藥物；合并其他臟器嚴(yán)重并發(fā)癥（心、肝、腎功能不全）；確診系因動(dòng)脈炎發(fā)病的腦梗死患者。對(duì)照組：收集同時(shí)期門(mén)診常規(guī)體檢的患有高血壓、糖尿病、高脂血癥、高黏血癥等基礎(chǔ)疾病者65例，其中男40例，女25例，年齡44歲～79歲（61.59歲±11.60歲），年齡、性別、伴隨疾病等情況與腦梗死組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 對(duì)兩組患者外周血進(jìn)行白介素－6（interleukin－6，IL－6）、白介 素－10（interleukin－10，IL－10）、腫 瘤 壞 死 因 子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）mRNA 表達(dá)的測(cè)定以及頸動(dòng)脈超聲檢查頸動(dòng)脈斑塊情況。

1.2.1 標(biāo)本采集和總RNA 提取 所有研究對(duì)象于入組當(dāng)天抽取靜脈血5mL，病例組采血必須在治療前。血液標(biāo)本采集后3h內(nèi)進(jìn)行總核糖核酸（RNA）的提取。加入適量的Trizol裂解細(xì)胞，再依次加入適量的氯仿、異丙醇、75%乙醇和DEPC水，分別純化、沉淀、洗滌和溶解總RNA。微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，吸光度D260mm／D280mm＞1.80表明純度高，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)總體積10μL，總RNA 模板250ng～300ng，25mmol／L MgCl22μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液1μL，各10 mmol／L的dNTPs混 合 物1μL，RNA酶 抑 制 劑0.2 5μL，5 U／μL AMV 反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，Oligo dT Adaptor 0.5μL，以無(wú)RNA 酶的滅菌水補(bǔ)充體積至10μL，混勻后稍離心。PCR 儀上42 ℃反應(yīng)30min，然后99 ℃加熱5min，冰浴保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光定量PCR 引物序列由上海生物工程技術(shù)公司合成。反應(yīng)總體積25μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性15s，72 ℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)后72 ℃采集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。65 ℃～94 ℃，每0.5 ℃讀取一次制備溶解曲線。表達(dá)水平以目的基因與內(nèi)參β－actin的比值表示。

1.2.4 頸動(dòng)脈超聲檢查評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［1］根據(jù)斑塊回聲強(qiáng)度和形態(tài)特點(diǎn)，分為扁平斑、軟斑、硬斑、潰瘍斑4型，軟斑和潰瘍斑合稱為不穩(wěn)定斑塊，余為穩(wěn)定斑塊。管腔直徑狹窄百分比：狹窄程度＝（1－d／D）×100%（D：遠(yuǎn)端正常管腔直徑，d：最小殘端直徑）；狹窄程度＞70%為重度狹窄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩 組 外 周 血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表 達(dá) 水 平 比 較

腦梗死組IL－6mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P ＜0.05），IL－10mRNA 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表達(dá)水平

表1 兩組外周血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表達(dá)水平

組別 n IL－6 IL－10 TNF－α腦梗死組128 0.92±0.47 0.58±0.32 1.46±0.79對(duì)照組 65 0.69±0.32 0.78±0.51 1.39±0.87 P ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

2.2 兩組頸動(dòng)脈斑塊檢出情況（見(jiàn)表2）

表2 兩組頸動(dòng)脈斑塊檢出情況 例（%）

2.3 腦梗死組中不同頸動(dòng)脈斑塊患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表達(dá)水平比較 穩(wěn)定斑塊組IL－6mRNA、TNF－α mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 高 于 對(duì) 照 組，IL－10 mRNA 表 達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 不同頸動(dòng)脈斑塊患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表達(dá)

表3 不同頸動(dòng)脈斑塊患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表達(dá)

組別 n IL－6 IL－10 TNF－α不穩(wěn)定斑塊組128 0.92±0.47 0.58±0.32 1.46±0.79穩(wěn)定斑塊組 65 0.69±0.32 0.78±0.51 1.39±0.87 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

腦梗死最重要的病因和病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，目前認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的形成是一種炎癥性病變的過(guò)程，并且炎癥活動(dòng)可以導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊以及血栓形成等，引起急性缺血性事件的發(fā)生。動(dòng)脈粥樣硬化是脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈壁形成局部斑塊的過(guò)程，炎癥介質(zhì)調(diào)控炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)，從而推動(dòng)粥樣硬化斑塊病變的進(jìn)展和斑塊結(jié)構(gòu)的改變［2］。頸動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、繼發(fā)性血栓形成與炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系，因此認(rèn)識(shí)頸動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥活動(dòng)相關(guān)的基因表達(dá)水平與缺血性卒中的關(guān)系，有利于盡早采取干預(yù)措施，對(duì)腦梗死的預(yù)防及治療有十分重要的臨床意義。

IL－6是一種具有炎癥調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)作用的多功能細(xì)胞因子，在缺血性腦損傷的腦組織中顯著增高、過(guò)度表達(dá)，可能參與繼發(fā)性腦損傷的過(guò)程。IL－6可以刺激急性期反應(yīng)蛋白合成增多，黏附分子表達(dá)增加，直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，并促進(jìn)凝血狀態(tài)和血管收縮，使興奮性氨基酸、一氧化氮釋放量增加，加重腦組織水腫、神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡。國(guó)外學(xué)者Tuttolomondo等［3］通過(guò)研究顯示，腦缺血后有明顯的炎癥反應(yīng)存在，且IL－6的表達(dá)明顯增加。IL－10是一種炎性抑制因子，Kucharzik等［4］研究發(fā)現(xiàn)，IL－10可抑制單核細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)，后者在動(dòng)脈硬化過(guò)程中早期參與介導(dǎo)單核細(xì)胞的聚集。TNF－α是一種重要的機(jī)體炎癥免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)因子，腦組織中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF－α。TNF－α是腦梗死引起全身炎癥反應(yīng)綜合征中的主要炎癥介質(zhì)，通過(guò)刺激或誘發(fā)多種細(xì)胞因子釋放、激活內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管擴(kuò)張、通透性增高；可以通過(guò)其激活作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面形成凝血活酶復(fù)合物，凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，使纖維蛋白原沉積于血管壁，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［5］。

頸動(dòng)脈粥樣硬化造成管腔狹窄是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，造成缺血性卒中的機(jī)制是斑塊不斷增大，直接阻塞血管；或狹窄的頸動(dòng)脈使遠(yuǎn)端的灌注壓下降，導(dǎo)致分水嶺區(qū)供血不足，形成低灌注性梗死。因此，頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)的監(jiān)測(cè)和狹窄程度的評(píng)估，對(duì)預(yù)測(cè)缺血性腦卒中有著重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死組炎癥因子基因表達(dá)水平明顯異常，頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊、高度狹窄的比例明顯升高，并且在不穩(wěn)定斑塊組中炎癥因子基因表達(dá)水平尤為異常。表明IL－6、TNF－α作為促炎因子，IL－10作為抗炎因子，與腦梗死急性期的炎癥反應(yīng)、頸動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)，在頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，并可能與動(dòng)脈硬化血栓形成存在因果關(guān)系。

外周血炎癥因子基因表達(dá)水平的異常與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展及腦梗死密切相關(guān)，及時(shí)開(kāi)展炎癥介質(zhì)的干預(yù)治療可能為穩(wěn)定頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊、預(yù)防和治療急性腦梗死開(kāi)辟新的途徑。

［1］ 何文.頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲與臨床［M］.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007：11－64.

［2］ Frisdal E，Lesnik P，Olivier M，et al.Interleukin－6protect human macrophages from cellular cholesterol accumulation an attenuates the proinflammatory response［J］.J Biol Chem，2011，286（35）：30926－30936.

［3］ Tuttolomondo A，Di Raimondo D，Di Sciacca R，et al.Infalmmatory cytokines in acute ischemic stroke［J］.Curr Pharm Desl，2008，14（33）：3574－3589.

［4］ Kucharzik T，Lugering N，Pauels HG，et al.IL－4，IL－10and IL－13 down－regulate monocyte－chemoattracting protein－1production in activated intestinal cell［J］.Clin Exp Immunal，1998，111：152.

［5］ 高強(qiáng)，何成奇.腦梗死生化指標(biāo)及其臨床意義的國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（2）：190－192.